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目的:将富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)与一种温敏型组织工程支架材料—羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)/β-磷酸三钙(tertiary calcium phosphate,β-TCP)/壳聚糖(chitosan,CS)复合,构建HTCP凝胶,并通过细胞学和动物实验验证其成骨效果。方法:1、HTCP水凝胶的制备:将10ml CS温敏凝胶、1ml PRF悬液与直径为0.25mm的HA和β-TCP(比例为3:7)混和,37℃孵箱15min,混合液凝结为固态,成为HA/β-TCP/CS/PRF凝胶(HTCP)。使用PH指示计进行PH值测定。通过倾斜试管的方法观察HTCP温敏水凝胶成胶时间。2、HTCP水凝胶对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响:取第3代BMSCs以105个/cm2细胞浓度接种于24孔培养板中,细胞贴壁后,实验组为常规成骨诱导液中加入新制备的HT CP水凝胶,对照组为常规成骨诱导液。成骨诱导8-14天时,观察两组细胞生长状态,3周时对两组行ALP染色,并做MTT比色法分析。3、HTCP水凝胶修复兔颅骨缺损的实验研究:在24只新西兰大耳白兔颅顶骨上各制备4个直径为6mm的骨缺损区。4个缺损区内按植入材料不同分为HTCP水凝胶组,HTC水凝胶组和PRF组,另设空白对照组,观察4、8、12周取材。对实验标本行大体观察,X线观察,CBCT观察,HE染色及BMP-2免疫组织化学染色。结果:1、获得的HTCP温敏水凝胶呈乳白色不透明液态,HA和β-TCP粉末颗粒悬浮于溶液中。测得PH值为6.5-7左右,在37℃恒温箱中静置15分钟后可凝胶化。2、MTT比色法分析BMSCs在HTCP水凝胶中可以正常存活和生长,未见明显细胞毒性。ALP染色提示HTCP水凝胶可能促进BMSCs向成骨细胞分化。3、动物实验结果:(l)大体观察显示,各组骨缺损区新骨生成随时间逐渐增多,第4、8周时,HTCP组的新骨形成量均优于对照组,第12周时,HTCP组与HTC组未见明显区别,但优于PRF组和空白对照组骨缺损修复。(2)影像学显示,各组缺损区透光区面积随时间延长而逐渐减小,术后4、8周,实验组透光区小于对照组。12周时HTCP组、HTC组、PRF组缺损区几乎无透光影,片状骨融合在一起,密度同周围骨质。(3)HE染色结果,术后4-8周HTCP组,骨小梁,成纤维细胞等较对照组多。HTC组和PRF组对于引导骨再生的能力差异不明显,但较空白组对骨缺损的修复均有促进和引导作用。12周时,HTCP组、HTC组、PRF组均有成熟的新骨与宿主骨融合,优于空白对照组。(4)BMP-2免疫组化观察:第4周,各组BMP-2抗体染色均为明显阳性,胞浆黄染;第8周,HTCP组BMP-2染色强阳性,其余各组为阳性,胞浆均被染成棕黄色;在12周时,各组阳性表达均有所减弱,未见明显差别。结论:HTCP水凝胶具有良好的生物相容性并促进BMSCs成骨分化,在兔颅骨缺损修复的早期和中期可取得较好的成骨效果,优于单独使用HTC或PRF。HTCP水凝胶作为一种温敏组织工程骨的支架材料可以促进骨缺损的愈合修复,具有良好的临床应用潜力。