背景和目的 肿瘤的发生发展与细胞增殖和凋亡调节失控密切相关。最近研究发现凋亡蛋白抑制因子家族(IAPs)的最小成员survivin在细胞增殖和凋亡的界面之间发挥重要调节作用,过表达于常见的恶性肿瘤组织,而在正常分化组织中沉默,使其成为一个非常有吸引力的癌症治疗靶点。在肿瘤细胞内导入凋亡抑制因子survivin拮抗物有可能成为肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。不少研究显示survivin是一潜在的抗癌治疗靶,并且反义survivin表达成功诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖,但在survivin反义应用研究中,许多关键问题亟需解决。首先,必须寻找抑制survivin表达的有效靶位。Survivin mRNA链长1619bp,以其不同编码区为靶序列的反义寡核苷酸对survivin表达抑制差异可能很大,必须通过体外和体内试验寻找安全有效的反义寡核苷酸序列,并确定剂量—反应曲线。其次,尽管对survivin的结构了解得比较清楚和它的抗凋亡功能得到公认,然而survivin在细胞生命活动如凋亡、细胞周期和有丝分裂增殖中的界面角色和作用机制仍有待进一步阐明。更重要的是survivin在不同肿瘤表达有很大差异,靶向抑制survivin表达能否影响一些常见肿瘤生长必须通过更多的浙江大学博士学位论文体外试验,并进而通过体内试验证实。 诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥杀伤作用的重要机制之一,而凋亡抑制基因Survivin的过表达导致了凋亡抑制,并与肿瘤化疗耐药有密切关系。反义技术可通过封闭凋亡基因的过表达,诱导凋亡,增强化疗敏感性。这正是当今备受关注的一种肿瘤耐药逆转的新策略。最近研究已经证明了反义抑制Survivin的表达能够增加多种肿瘤细胞系(包括肝癌)对化疗的敏感性,但这些研究主要讨论的是敏感细胞系,而反义Survivin表达能否使耐药细胞系对化疗敏感,甚至对原耐受的化疗药物增敏有待进一步阐明。这对于预防肿瘤的发生发展及手术后抗复发治疗有着潜在的巨大价值。肝癌手术切除率低,复发率高、对化放疗均不敏感,预后很差,至今缺乏有效的治疗手段,鱼需探索新的治疗方法。最新研究表明,survivin广泛表达于HepGZ,Huh7和SK一Hepl等肝癌细胞系及人肝癌组织,与肝癌细胞增殖和凋亡密切相关,也是其对放化疗不敏感的原因之一。 本研究试图设计、筛选和确定能有效抑制肝癌细胞系survivin表达的反义复合物,进而探讨其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响;反义干扰survivin抗凋亡功能对肝癌细胞的细胞周期、细胞分裂和Survivin亚细胞定位的影响,阐明过表达survivin在肝癌细胞增殖和凋亡界面角色及作用机制;探讨survivin基因表达与肝癌细胞耐药的关系及反义抑制survivin表达恢复耐药肝癌细胞系对阿霉素的敏感性,阐明反义寡核昔酸和阿霉素的联合应用,可能是将来耐阿霉素肝细胞癌临床治疗的一种合理策略;建立肝癌裸鼠模型,验证反义复合物对肝癌细胞裸鼠体内移植瘤的生长影响,为肝癌及survivin阳性肿瘤治疗提供新途径。浙江大学博士学位论文方法和结果 本课题分以下几部分研究: 研究一:影响。特异反义复合物抑制Survivin表达对肝癌细胞增殖和凋亡效应的 方法:根据GenBank、RNAdraw设计程序和BLAST同源分析,预测和确定一系列20一mer反义硫磷酞寡核昔酸序列靶向SuI’vivin mRNA不同区域的候选序列。分别转染H即GZ细胞系,MTT法筛选出有效的反义寡核营酸序列。通过改变反义寡核昔酸:脂质体(l:0.5一l:5)比率,利用RT-pCR、Westernblot实验,构建并优化能有效抑制肝癌细胞Survivin表达的反义复合物。MTT法检测细胞生长情况。流式细胞术测定Caspase一3活性及凋亡率。电镜观察细胞形态学变化。 结果:针对S盯vivin mR触核营酸号为232一251(翻译区)的反义寡核营酸序列m是最有效的序列,而针对翻译起始ATG位置的序列I(39一58)及其他翻译区序列11(97一116)、IV(329一348)、V(821一840)和Vl(1461一1480)序列均无效。反义寡核昔酸序列m:脂质体(1:4,1:5)为最有效的反义复合物,而反义复合物(1:0.5一1:3)不能达到最大效应。鉴于脂质体有轻度细胞毒性,故本实验选择反义复合物(1:4)。反义复合物〔1:4)转染肝癌细胞有效下调survivin表达水平,呈剂量依赖关系,IC50值为250nmol几,最大效应浓度为SOOnmol/L,此时表达水平下调了80%。类似细胞生长抑制结果为川’f实验所证实。与此同时,Caspase一3活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,并出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。 研究二:反义干扰Survivin抗凋亡功能对肝癌细胞细胞周期,细胞分裂和survivin蛋白分子亚细胞定位的影响. 方法:用脂质体介导survivin反义寡核昔酸转染肝癌细胞系HePGZ。通过RT-PCR,Western blot检测survivin的表达水平。流式细胞术测定easpase一3的浙江大学博士学位论文活性及凋亡率。应用流式细胞仪同步分析反义复合物对HePGZ增殖周期和倍体数的影响。用反向相差显微镜和电子显微镜观察细胞核形态学的变化。应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物在亚细胞水平对survivin蛋白分子的影响。 结果:在反义复合物转染的H即GZ细胞中,反义干扰survivin的功能导致了正在分裂增殖细?