支气管哮喘是全球范围内发病率较高的慢性气道疾病之一，在不同区域和国家该疾病影响着5-16%的人群，这一疾病的反复发作、逐渐加重，仍旧给患者、家庭、社会带来了沉重的负担。为了能够有效治疗、控制甚至攻克这一疾病，近百年来，科学工作者和临床工作者在不断的致力于对这一疾病发病机理及治疗的探索中。目前，比较公认的一个经典理论认为，支气管哮喘是一种2型T辅助细胞依赖的气道免疫紊乱性疾病，在这一过程中主要由IgE参与调解，而树突状细胞在其中发挥了重要的作用——携带了抗原的树突状细胞到达纵隔淋巴结T细胞聚集区域，随后出现表型的改变，表达一系列共刺激分子和较高水平的Ⅱ类主要组织相容性复合体，这些成分能诱导幼稚的T淋巴细胞产生增殖和分化，分化产生的不同T淋巴细胞再作用于气道，在支气管哮喘这一炎症过程中发挥不同的作用。由于树突状细胞在支气管哮喘发生、发展中所起到的重要作用，探索树突状细胞作用机制以及通过改变树突状细胞的表型及功能的研究进而治疗支气管哮喘的相关研究也越来越多。间充质干细胞作为一类中胚层来源的多能干细胞，近年来在支气管哮喘的治疗中逐渐崭露头角。在本课题组前期的实验结果中，经尾静脉或经气道输注间充质干细胞至支气管哮喘小鼠模型后，间充质干细胞能够停留于肺组织内发挥作用，明显改善哮喘小鼠肺部的炎症细胞浸润情况和肺功能等情况。通过分析肺泡灌洗液、肺组织间液，并进行同位素示踪标记等方法，我们认为该细胞是通过其免疫调节作用来改善这一疾病的病情，并且这一免疫调节过程中树突状细胞作为中间环节可能发挥着重要的作用。而在分离、提取、鉴定、检测不同小鼠间充质干细胞时，我们发现Fcgr2b缺陷的B6小鼠，其骨髓获得的间充质干细胞相较于野生的B6小鼠间充质干细胞在细胞形态、表型等方面大致相同，但它们对于哮喘小鼠模型的治疗作用以及对于树突状细胞功能的影响存在着明显的差异。是何种原因导致这一差异的出现呢？我们通过前期预实验后，逐渐将研究的重心置于COX-2和PGE2这一具有抑制树突状细胞成熟、缓解气道痉挛等多项功能的分子上。【实验目的】：探讨Fcgr2b缺陷与正常的间充质干细胞对于树突状细胞功能及支气管哮喘病情影响的差异，并探讨出现这一差异的原因。【实验方法】：一、体外实验：分别分离培养野生型C57小鼠及Fcgr2b缺陷小鼠的骨髓间充质干细胞进行培养、鉴定后进行如下实验：（一）将间充质干细胞与树突状细胞共培养，并通过LPS刺激树突状细胞促使其成熟，将共培养后的树突状细胞分为3部分：1、进行流式检测表面分子CD11c、I-Ab（即MHC Ⅱ）、CD86等以观察树突状细胞的成熟情况；2、将所得到的树突状细胞继续培养，而后检测树突状细胞上清液中的IL-12，通过比较IL-12水平的不同来观察树突状细胞的成熟情况；3、将树突状细胞分组与OTⅡ小鼠脾脏T淋巴细胞培养并以OVA-17肽刺激T细胞增殖，而后通过流式细胞仪检测CD4+T细胞的分裂增殖情况以推断树突状细胞的功能。（二）间充质干细胞方面的相关检测：1、提取野生型和缺陷型两种小鼠的间充质干细胞的mRNA，进行反转录后得到cDNA，再进行定量PCR检测；2、提取两种间充质干细胞的蛋白，而后进行蛋白印迹实验；3、检测野生型和缺陷型两种小鼠的间充质干细胞上清液中PGE2分子的水平，采用ELISA检测法。二、体内实验：分组建立急性支气管哮喘模型：Balb/c小鼠分为4组（每组4只）：空白对照组（NC组，即生理盐水致敏生理盐水激发组）、急性哮喘对照组（AC组，即OVA致敏21天OVA雾化吸入4天组）、野生间充质干细胞治疗组（T1组，即OVA致敏21天后于OVA雾化吸入前半小时尾静脉注射野生型间充质干细胞组，每只注射剂量为1×106个细胞，注射后同样条件下OVA雾化吸入4天）、Fcgr2b缺陷间充质干细胞治疗组（T2组，即OVA致敏21天后于OVA雾化吸入前半小时尾静脉注射Fcgr2b缺陷间充质干细胞组，每只注射剂量为1×106个细胞，注射后同样条件下OVA雾化吸入4天），在末次雾化后1小时内处置完所有小鼠，并检测比较小鼠血清IgE水平、肺泡灌洗液细胞数及分类情况、肺泡灌洗液上清液IL-4、IL-13、IL-10和PGE2水平的差异，以及肺组织病理切片HE染色。【实验结果】：（一）体内实验：1、野生型间充质干细胞表达有较高水平的CD32分子（Fcgr2b），而Fcgr2b缺失的间充质干细胞表面无CD32分子的表达；2、经间充质干细胞作用后，CD11c+树突状细胞表面I-Ab（即MHC Ⅱ）、CD86等表面分子的表达水平减低、培养上清液中IL-12的水平减低，野生型间充质干细胞作用后，CD11c+树突状细胞表面I-Ab、CD86等表面分子的表达水平及培养上清液中IL-12的水平较Fcgr2b缺陷细胞的更低；3、经间充质干细胞作用后的树突状细胞对于T细胞的分裂、增殖具有抑制作用，且经野生型间充质干细胞作用后的树突状细胞的抑制作用强于Fcgr2b缺陷细胞作用后的；4、野生型间充质干细胞COX-2的表达明显高于Fcgr2b缺陷组，并且野生组的PGE2水平也明显高于缺陷组。（二）体外实验：1、AC组血清IgE水平明显高于NC组（p＜0.001），T1组及T2组血清IgE水平明显低于AC组（p＜0.001），T1组血清IgE水平低于T2组（p＜0.05）；2、AC组肺泡灌洗液中细胞数明显高于NC组（p＜0.001），T1组及T2组肺泡灌洗液中细胞数明显低于AC组（p＜0.05），T1组肺泡灌洗液中细胞数明显低于T2组，并且具有统计学意义（p＜0.05）；3、AC组肺泡灌洗液中IL-4和IL-13明显高于NC组（p＜0.0001），T1组及T2组肺泡灌洗液中IL-4和IL-13明显低于AC组（p＜0.001），T1组肺泡灌洗液中IL-4和IL-13低于T2组（p＜0.05）；AC组肺泡灌洗液中IL-10明显低于NC组（p＜0.01），T1及T2组肺泡灌洗液中IL-10明显高于AC组（p＜0.001），T1组肺泡灌洗液中IL-10高于T2组（p＜0.05）；T1及T2组肺泡灌洗液中PGE2明显高于AC组（p小于0.001），T1组肺泡灌洗液中PGE2高于T2组（p＜0.05）；4、肺组织的病理染色（HE染色）：NC组小鼠肺部病理切片可见其肺泡结构清晰、粘膜无水肿、无增厚、视野中细胞数较少；AC组肺部切片中可以看到大量的炎症细胞浸润、粘膜水肿，并且小气道中可见较明显的粘液栓子，哮喘病情较重；T1组、T2两组炎症细胞的浸润情况均明显少于AC组，并且粘液栓较少，这其中以T1组减少的更加明显。【实验结论】：间充质干细胞能够明显的抑制树突状细胞的成熟和T细胞的分裂增殖，能够改善支气管哮喘小鼠的病情。野生型间充质干细胞所表达的COX-2的水平及分泌的PGE2的水平明显高于Fcgr2b缺陷型间充质干细胞，野生型间充质干细胞对树突状细胞的抑制作用、对T细胞分裂的抑制作用以及对支气管哮喘的改善作用均强于Fcgr2b缺陷型间充质干细胞。