论文部分内容阅读
背景我国每年肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均名列前位,占全球每年因肝癌死亡人数的一半以上。目前,原发性肝癌的手术治疗仅限于早期的病人,并且即使是根治性切除,但5年内仍有50%以上的病人转移复发;放、化疗等对肝癌病人的治疗作用非常有限,肝癌病人的总体5年生存率仍徘徊在5%左右。多年来依据经典肿瘤理论的研究投入大量了精力和基金研究未能对肝癌的预后明显提高,使得学者们对一直以来的肝癌经典肿瘤理论的研究陷入了迷茫?因此,运用肿瘤干细胞学说对于理解肝癌发生发展的具体机制和寻找确切有效的早期检测及判断预后、有效治疗具有重大的意义。经典肿瘤学说认为:肿瘤细胞的起源大部分来源于成熟的组织细胞,因此肿瘤组织中肿瘤细胞的生物学特性具有大部分一致性。但在肿瘤干细胞学说中,肿瘤细胞的起源被认为来自组织中的干细胞,因此肿瘤组织中的肿瘤细胞生物学特性具有异质性。肿瘤干细胞学说的关键观点是:肿瘤是由一些具有异质性的肿瘤细胞群构成,在其中仅有少数的细胞可以具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能,这些细胞被认为是肿瘤的起始细胞并维持了肿瘤的持续生长,剩下其余大部分的肿瘤细胞仅仅具有相对的增殖和分化能力,由于这一特征类似于正常生理状态下的成体干细胞或胚胎干细胞,这些细胞被称为肿瘤干细胞,肿瘤干细胞在肿瘤的起始、进展过程、发生转移和产生复发过程中起关键作用,因此是肿瘤所需治疗的核心所在。肿瘤干细胞学说已在白血病、乳腺癌、脑胶质瘤、结肠癌、黑色素瘤等肿瘤中得到了确实验证。近年来,无论是动物模型研究还是临床基础研究,原发性肝癌的肿瘤干细胞的存在也得到了越来越多的证实,最新相关文献报道目前研究仍无确切的标记物能准确检测人肝癌干细胞。为了解清楚肝癌干细胞的本质,首当其冲的任务是将人肝癌组织及细胞系中的csc分离、纯化并进行鉴定,国内外众多学者作为热点正在探索研究。目的本研究通过体外实验检测比较人肝癌细胞株smmc-7721细胞表面cd105、cd133的表达情况及各亚群间生物学性状的差异,通过体内实验了解cd105、cd133各亚群的成瘤能力,分析探讨cd105+cd133+细胞亚群在人肝癌细胞株smmc-7721的干细胞特性;为进一步理解肝癌发生发展及早期检测、判断预后、有效治疗提供理论依据。方法采用含10%胎牛血清的dmem培养基培养人肝癌细胞株smmc-7721细胞;采用流式细胞仪方法在该细胞株中分选检测cd105、cd133表达情况,再进行体外体内实验。在体外实验中将经流式细胞术分选出的cd105+cd133+亚群、cd105-cd133+亚群、cd105+cd133-亚群、cd105-cd133-亚群四种细胞以cck-8法检测od450值,以比较各亚群细胞增殖能力;采用软琼脂克隆试验来了解和比较四种亚群细胞的成球能力;选用transwell方法比较四种亚群细胞的侵袭能力;测定分选后各亚群细胞的bmil基因的表达情况;在体内实验中采用裸鼠成瘤实验,了解裸鼠成瘤时间、测定裸鼠成瘤体积,分析上述各亚群细胞在裸鼠中的成瘤能力。结果在人原发性肝癌细胞株smmc-7721中,流式细胞仪分选后四种细胞亚群cd105+cd133+、cd105-cd133+、cd105+cd133-、cd105-cd133-的比例分别为1.61%,0.01%,97.88%和0.50%。cck-8检测的结果显示cd133+亚群与cd133-亚群之间的od450值比较有统计学意义(p<0.05),而cd105+cd133-亚群和cd105-cd133-亚群的od450值比较无统计学差异,cd105-cd133+和cd105+cd133+亚群之间的od450值比较也无统计学差异;在软琼脂克隆实验中,cd133+亚群与cd133-亚群之间得到的克隆数比较有统计学差异(p<0.05),其中CD133+亚群形成的克隆数多于CD133-亚群;Transwell侵袭试验结果显示比较CD105+亚群和CD105-亚群的穿膜细胞数,两者有统计学差异(P<0.05),CD105+亚群穿膜细胞数明显多。RT-PCR半定量光密度比值(Bmil/β-actin mRNA)的结果提示流式细胞仪分选后CD105+CD133+、CD105-CD133+的二亚群组在细胞培养后在mRNA水平测定的Bmil表达量明显升高,与对照未分选组比较有统计学意义(P<0.01),而CD105+CD133-和CD105-CD133-的二亚群细胞组培养后mRNA水平的Bmil表达量有下降趋势,与未分选组相比有统计学意义(P<0.01);体内成瘤实验显示CD105+CD133+组成瘤所需时间短、所需细胞少、成瘤的体积大,与未分选组及CD105-CD133-组相比有统计学意义(P<0.05)。结论本研究发现,在人肝癌细胞株SMMC-7721中用流式细胞仪能成功分选出四种细胞亚群CD105+CD133+、CD105-CD133+、CD105+CD133-、CD105-CD133-,体外增殖实验、体外克隆实验、体外侵袭实验及RT-PCR半定量光密度比值(Bmil/β-actin mRNA)的结果均证明了CD105+CD133+具有异常高的增殖潜能、自我更新和分化的能力,体内成瘤实验证明了CD105+CD133+具有体内高度的成瘤能力,而相应的CD105-CD133-亚群和未分选组则相对微弱。因此,CD105+CD133+亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性,CD133、CD105双阳性细胞代表了恶性程度更高的肝脏原始癌细胞可能。