创伤和各种肝病后，残存肝组织很快会进入复杂的再生过程。研究肝再生分子机理必将对肝脏移植、创伤、各种肝病及肝肿瘤诊治具有重要意义。但是目前对肝再生的分子机理，尤其是肝再生启动和终止的机制仍不清楚。而能量代谢的调控始终是肝细胞再生过程中的重要环节，线粒体不仅为细胞生命活动提供所需的能量，而且直接参与细胞内许多信号转导过程。许多研究表明线粒体通透性转换(permeability transition，PT)是这一切功能的重要环节，在肝再生过程中线粒体通透性发生了明显变化，这对肝再生可能具有重要意义。 因此，我们对大鼠肝再生过程中线粒体PT时相规律进行了研究：发现大鼠肝再生过程中肝部分切除(70％partial hepatectomy，PH)后3h和6h肝线粒体有一定的收缩，24h线粒体通透性明显升高和线粒体明显肿胀，在肝再生后期(PH后120～168h)肝线粒体又经历了收缩和肿胀的变化过程。这提示线粒体PT可能与肝再生的启动与终止有关。线粒体PT的物质基础是线粒体内膜和外膜接触点处存在的一种蛋白性孔道，即所谓线粒体通透性转换孔(permeability transition pore，PTP)。PTP具有可逆性开闭的特性，异常的高通透性开放会导致线粒体跨膜电位消失和凋亡因子释放等。PTP是线粒体内外信息交流的环节，功能的发挥依赖于其开闭的状态。多种因素可调节PTP开闭，除了自由基、Ca<2+>等因素外，还有一些调节相关蛋白：PBR是线粒体PTP的一个重要组分和调节蛋白，在调节线粒体诱导的凋亡中起重要作用。苯二氮卓类结合抑制因子(diazapam-binding inhibitor，DBI)是PBR的内源性配体，能够取代苯二氮卓类与PBR结合，普遍存在于生物体中，DBI与PBR相互作用能够通过调节线粒体PT，诱导细胞凋亡，DBI能与脂酰CoA结合，促进其转运入线粒体基质，调节能量代谢，促进线粒体合成类固醇，所以DBI又被称为脂酰CoA结合蛋白(acyl-CoA-binding protein)。 活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)是一个重要的PT诱导因素，而线粒体消耗的氧约有2～5％用于生成ROS，主要是呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ漏出的电子直接与氧反应生成的；线粒体PTP开放又可引起线粒体产生ROS。有研究报导肝再生早期自由基与线粒体功能两者呈现十分明显的消长关系，这表明在肝再生过程中对ROS变化的规律与线粒体PT变化关系的研究，将有助于认识肝再生过程中调节肝细胞线粒体PT的可能机理。 Ca<2+>也是一个重要的线粒体PT诱导因素，有研究报导在肝再生过程中线粒体中Ca<2+>浓度发生变化，当Ca<2+>由胞质中进入线粒体基质中时，线粒体中Ca<2+>浓度增加，会导致线粒体膜电位的改变，继而调节PTP的开放。Ca<2+>增加可以诱导ROS的产生，从而使线粒体膜通透性升高，同时Ca<2+>也可以通过线粒体PTP转运，从而来调节细胞和线粒体的功能，如线粒体呼吸加快，电子漏增加而导致超氧阴离子产生。因此，在肝再生过程中对线粒体中Ca<2+>浓度变化规律的研究，将有助于认识线粒体PT的可能调节机制。 鉴于上述分析，本课题利用经典的大鼠肝再生模型，对PBR和DBI表达的动态变化规律以及活性氧族和Ca<2+>的动态变化规律进行研究，探讨在肝再生过程中线粒体通透性转换的可能机制，为更好的阐明肝细胞再生的分子机理提供实验依据。 一、肝再生过程中线粒体PBR及DBI表达的变化研究肝细胞线粒体PT的主要调节蛋白PBR及其配体DBI的表达，探讨与线粒体PT的关系。分别以荧光定量RT-PCR方法检测PBR和DBI在肝再生过程中mRNA表达的动态变化，以免疫组织化学方法检测PBR在肝再生过程中蛋白水平的变化。 结果显示，肝再生过程中PBR基因表达在6h和2d表达显著高于正常组和假处理组(P<0.01)，其他时间点与假处理组比较无显著差异；DBI基因表达在3h和6h显著低于正常组和假处理组(P<0.01)，2d的基因表达高于假处理组(P<0.05)，其他时间点与假处理组比较无显著差异。 PBR蛋白阳性细胞数目在6h、12h显著低于正常组(P<0.01)，3d显著高于正常组(P<0.01)，其他时间点与正常组比较无显著差异；PBR蛋白的阳性细胞平均灰度值在6h高于正常组(P<0.05)，12h低于正常组(P<0.05)，2d和3d具有显著差异(P<0.01)，其他时间点与正常组比较无显著差异。在肝再生过程中PBR在细胞中分布发生改变，从6h开始，PBR在线粒体膜上分布增多，在2d和3d分布最多，5d和7d在胞膜上分布增多。 结果提示，肝再生过程中PBR和DBI表达，以及PBR分布变化可能与线粒体PT存在正相关，可能与肝细胞的增殖和线粒体PT诱导的凋亡调节有关。 二、肝再生过程中肝细胞内自由基的变化ROS是另外一个重要的PT诱导因素，本研究分别利用TBA法和硝酸还原法检测MDA和NO在肝再生过程中的变化。 结果显示，PH后3h、6h和24h MDA含量高于假处理组(P<0.05)，2dMDA含量与假处理组比较显著升高(P<0.01)，其他时间点与假处理组比较无显著差异。 肝再生过程中NO的变化：PH后3h、6h和24h NO含量高于对照组(P<0.05)，2d、3d和7dNO含量升高与假处理组比较具有显著差异(P<0.01)，其他时间点与对照组比较无显著差异。 结果提示，肝再生早期自由基的升高可能与肝再生早期的线粒体PT变化有关；在肝再生中期(PH后24h～2d)MDA和NO升高，以及后期(PH后7d)NO 升高可能与线粒体PT升高介导的细胞凋亡相关。 三、肝再生过程中线粒体Ca<2+>浓度的变化在肝再生过程中对线粒体中Ca<2+>浓度变化规律的研究，将有助于认识线粒体PT的可能调节机制。 结果显示，PH后12h和7d线粒体Ca<2+>浓度高于对照组(P<0.05)，24h和2d线粒体Ca<2+>浓度与对照组比较显著升高(P<0.01)，其他时间点与对照组比较无显著差异。 结果提示，在肝再生过程中，线粒体中钙浓度的增高可能与线粒体PT增高呈正相关；在肝再生后期(PH后7d)NO增高与Ca<2+>浓度的升高一致，可能存在相关性。 小结：肝再生过程中PBR和DBI表达，以及PBR分布变化可能与线粒体PT存在正相关，可能与肝细胞的增殖和线粒体PT诱导的凋亡调节有关：肝再生早期自由基的升高可能与肝再生早期的线粒体PT变化有关；而后期NO升高可能与线粒体在肝再生后期的PT和细胞凋亡活性增高相关；线粒体中钙浓度的增高可能与线粒体PT增高呈正相关：在肝再生后期(PH后7d)NO增高与Ca<2+>浓度的升高一致，可能存在相关性。