研究背景脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV),包括血管发生和血管生成过程,是多种可造成严重不可逆视力丧失的视网膜疾病的共同病理基础。在近几十年的努力中,对于CNV的病理生理机制和防治策略的研究已经取得了不少成绩。然而,CNV的发展是一个非常复杂的动态过程。对于其发生发展的具体机制仍然知之甚少。Delta样配体4(Delta-like ligand 4, Dll4)是Notch信号系统家族在哺乳动物细胞中的配体之一,特异性的表达于生理性和病理性的血管系。值得注意的是,小鼠基因敲除的研究中发现,单一Dll4等位基因缺失便会由于血管系统的发育障碍而导致小鼠胚胎期死亡。到目前为止,已知的仅有两个血管发育相关基因,Dll4和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),具有半剂量等位基因致死效应,表明其在血管发生及生成过程中发挥着关键作用。以往的研究中发现,缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF- 1)对于调控视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的功能非常重要,参与RPE细胞在受到多种来自于视网膜、Bruch’s膜及脉络膜毛细血管微环境中如缺氧等刺激因素的影响后诱导CNV发生的起始过程。缺氧环境下,RPE细胞可通过HIF-1α-VEGF通路信号介导,影响脉络膜微血管内皮细胞(choroidal microvascular endothelial cells,CECs)的功能,从而调控CNV的发生发展。而已有研究报道发现,Dll4属于缺氧调控基因,在内皮细胞(endothelial cells,ECs)功能中,它不仅可以直接受到HIF-1的信号诱导,同时也可接受HIF-1-VEGF通路信号调节。结合这些研究结果,我们推测,在视网膜脉络膜疾病的病理变化中,Dll4/Notch信号可能参与HIF-1α-VEGF信号途径调节CNV的血管生成。并且,我们课题组的研究已首次证实,Notch信号参与到CNV的调控,其信号的缺失将导致小鼠的激光诱导CNV模型发生更为严重的新生血管生成。然而,对于Dll4/Notch信号在CNV中调控作用的具体机制目前还尚未见报道。目的本研究拟观察环境缺氧刺激下Dll4在眼内细胞的表达情况,探讨Dll4在参与调控CNV生成过程中与HIF-1α-VEGF信号通路间的关系,并应用共培养体系,模拟体内环境状态下RPE细胞与CECs之间的关系,以观察Dll4在缺氧条件下RPE细胞诱导CECs功能变化过程中发挥的具体作用。方法1.在本研究中,为了便于实验操作及相关研究,我们选择了与人CECs高度同源的恒河猴脉络膜视网膜微血管内皮细胞系——RF/6A细胞用来进行实验研究。对于体外培养的RF/6A细胞和RPE细胞进行CoCl2诱导的化学缺氧刺激,并建立RPE-RF/6A接触/非接触共培养体系以探讨Dll4参与HIF -1α-VEGF通路途径影响CNV调控的具体作用。2.应用实时定量PCR和Western blotting方法,分析Dll4、VEGF以及HIF -1α在缺氧的RF/6A细胞中的表达变化。通过shRNA干扰、免疫荧光染色法分析几个因子之间的相互作用关系。对RF/6A细胞进行体外转染,通过转染表达全长Dll4的质粒或靶向Dll4的siRNA形成Dll4不同表达水平的内皮细胞系。此外,应用Notch通路抑制剂γ分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor, GSI)阻断整个Notch通路信号。然后用不同Dll4/Notch通路信号水平的RF/6A细胞与RPE细胞在缺氧条件下共培养,观察由RPE诱导的RF/6A细胞功能改变情况。3.另外,通过免疫荧光染色检测了Dll4在RPE细胞中的表达,并利用实时定量PCR和Western blotting检测方法,分析了RPE细胞中Dll4在化学缺氧刺激下的表达变化。同时,通过体外转染技术改变RPE细胞中的Dll4表达水平,观察其对RPE细胞增殖、迁移和侵袭等功能的影响。结果1.研究显示RF/6A细胞中Dll4的mRNA和蛋白表达水平在CoCl2诱导的化学缺氧条件下显著上调,呈时间依赖性改变,并且这种上调变化受到HIF-1α以及VEGF的信号介导。共培养体系的结果表明,在缺氧的RPE细胞诱导条件下,提高RF/6A的Dll4表达水平使得细胞增殖能力和血管形成能力增强,但侵袭能力减弱。siRNA抑制细胞中Dll4的表达后则使细胞功能呈现相反的改变。药物性阻断剂GSI完全阻断Notch通路信号后对RF/6A细胞功能产生的作用与单纯抑制Dll4的作用一致,但不完全相同。接触共培养体系中观察到Dll4具有抑制RF/6A细胞穿透RPE细胞单层的作用。此外,我们还发现VEGFR1、VEGFR2、EphrinB2和EphB4,几个关键的CNV调控相关因子,在组成性过表达Dll4的RF/6A细胞中表达发生显著性改变,为RF/6A细胞行为学的变化提供了机制分析。2.另外,对于Dll4在RPE细胞中的初步研究发现:RPE细胞中存在Dll4的表达,缺氧诱导刺激下,RPE细胞中Dll4的mRNA和蛋白表达增加呈时间依赖性改变。应用体外转染技术改变RPE细胞中Dll4的表达水平以及药物性阻断Notch通路信号后发现,Dll4对RPE细胞的增殖具有促进作用,但对移行和侵袭呈现抑制作用。此外,接触RPE-RF/6A共培养体系中观察到,在RPE细胞中组成性过表达Dll4将阻碍RF/6A细胞穿过RPE细胞层的过程。结论Dll4是一个重要的血管调节因子,它参与到CNV的血管生成过程中,其作用可能是通过HIF -1α-VEGF信号通路作用调节缺氧条件下的CNV进展。靶向Dll4/Notch信号研究可能为治疗眼内血管性病变提供新的策略。