支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，气道高反应性及气道重塑是其主要的两大特征，而气道上皮下纤维化又是气道重塑的核心，是重症哮喘患者死亡的主要原因之一。大量成纤维细胞在气道上皮下聚集以及细胞外基质的沉积导致了气道上皮下纤维化。细胞外基质的主要成分是I型胶原蛋白。I型胶原蛋白是由2个alpha1和1个alpha2胶原蛋白分子组成的异三聚体，呈螺旋结构，分别由COL1A1及COL1A2基因编码。成纤维细胞是合成I型胶原蛋白的主要细胞。迄今为止，没有直接针对气道上皮下纤维化的有效的治疗方法。因此寻找探索其形成机制和阻断办法具有重要的理论和实际意义。Notch信号通路在进化上高度保守，它由Notch受体、配体及其下游分子组成，通过相邻的细胞之间受体和配体的相互作用而传递生物信息，对细胞的增殖、分化和凋亡具有重要调节作用，影响着生命体的生长和发育。在哺乳动物Notch通路由4种Notch受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、5种Notch配体（Jagged1、Jagged2；Delta1、Delta3、Delta4）、细胞核内蛋白效应器（CSL：CBFl/Suppresor of Hairless/Lag1分别指哺乳动物、果蝇、线虫中的名称等）以及Notch下游靶基因编码的转录因子Hes1等蛋白分子组成。Notch胞内段（Notchintracellular domain，NICD）是Notch信号通路的活性片段，在Notch受体与配体结合时，由γ-分泌酶从细胞膜水解出来，并迁移到细胞核内，与Notch的下游效应蛋白CSL结合，从而激活Notch靶基因的转录，Notch下游靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，激活后编码Hes1等转录因子，发挥基因转录调控作用，促进细胞增殖，抑制细胞分化等。目前有关Notch信号通路与疾病关系的研究已成为疾病研究的热点领域。研究表明Notch信号通路对胚胎期肺的生长、发育，对肺癌、哮喘等疾患的发生、发展具有调控作用。有关Notch与纤维化的研究进一步表明，Notch信号通路对肺脏、肾脏、肝脏、心肌及系统性硬化病等的纤维化形成具有重要影响。目前认为气道上皮下纤维化是气道上皮基底膜下网状板层的增厚，且最终导致基底膜增厚。气道粘膜上皮基底膜下网状板层在胚胎期并不存在，随着发育而逐渐出现。在哮喘个体由于成纤维细胞聚集和细胞外基质的沉积使该层明显增厚最终导致上皮下纤维化。这种纤维化是否也象上述脏器纤维化一样受到Notch信号调控，调控基质产生的分子机制如何尚未见报道。由于Col1α1及Col1α2是哮喘上皮下纤维化的重要物质基础，因此，我们针对人和鼠的胶原蛋白编码基因COL1A1及COL1A2的启动子进行了生物学信息分析，发现COL1A1及COL1A2启动子上游及附近均有Notch信号通路下游的转录因子Hes1的结合位点即N-box位点（CACNAG）。由此，我们提出这样的假设：哮喘状态时，Notch信号通路通过Hes1依赖方式调控成纤维细胞表达Col1α1及Col1α2，从而调控气道上皮下纤维化。为验证这个假设我们进行了以下研究：实验方法：1.用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和Western blotting方法从mRNA和蛋白水平检测小鼠成纤维细胞L929、人胚肺成纤维细胞MRC-5及小鼠肺上皮细胞CMT64等三个细胞系的Notch受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、配体（Jagged1、Jagged2；Delta1、Delta3、Delta4）及下游关键靶因子Hes1的表达情况。2.通过上调和下调Notch信号通路，分别用Real-time PCR和Western blotting方法在mRNA和蛋白水平检测小鼠L929及人MRC-5细胞系Col1α1及Col1α2表达水平的变化。3.通过小鼠和人的COL1A1及COL1A2启动子萤光素酶（Luciferase）报告基因实验、小鼠和人的COL1A1及COL1A2N-box位点突变后的启动子Luciferase报告基因实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）实验及DNA-Pull down实验，观察Notch信号通路对小鼠和人COL1A1及COL1A2启动子活性的直接影响，以及Hes1在Notch信号通路调节COL1A1及COL1A2启动子活性中的作用。4.建立小鼠哮喘模型，检测鸡卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的哮喘模型小鼠及其对照小鼠肺组织中Notch通路各分子表达情况。5.用Notch信号通路抑制剂KyoT2重组腺病毒表达载体滴鼻观察小鼠肺内Hes1的表达情况。6.用Notch信号通路抑制剂KyoT2重组腺病毒表达载体滴鼻干预OVA诱导哮喘模型小鼠，观察KyoT2对哮喘模型小鼠气道上皮下纤维化和气道高反应的影响。实验结果：1.在L929、MRC-5及CMT64细胞中，Notch各分子的表达具有细胞特异性，但Notch1, Hes1作为Notch通路关键的分子在三种细胞中均有不同程度的表达。2.在转化生长因子β1（Transforming growth factor β1, TGF-β1）存在的情况下Notch的活性段NICD能上调Col1α1及Col1α2在小鼠L929及人MRC-5细胞中的表达。Notch的抑制剂γ-分泌酶抑制剂（N-3,5-difluorophenyl acetyl-L-alanyl-2-phenylglycin-1,1-dimethylethyl ester, DAPT）能下调Col1α1及Col1α2在小鼠L929及人MRC-5细胞中的表达。3. COL1A1及COL1A2启动子的活性呈NICD浓度依赖性，其Hes1的结合位点N-box位点突变后NICD对COL1A1及COL1A2的活性无影响。4. Hes1蛋白抗体能将小鼠L929及人MRC-5细胞COL1A1及COL1A2启动子DNA沉淀下来；含N-box位点的COL1A1及COL1A2启动子能从L929及人MRC-5核蛋白提取物中将Hes1蛋白沉淀下来。5.在OVA诱导的慢性哮喘模型小鼠及对照小鼠中Notch各分子的表达也不同，与对照小鼠比较哮喘模型鼠的Notch1、Notch2、Notch4、Jagged1、Jagged2、Delta4、Hes1均明显上升，Notch3、Delta1、Delta3的表达却下降。6. OVA诱导的哮喘模型鼠气道重塑各项指标，如胶原沉积、上皮下纤维化、基底膜增厚、气道平滑肌增生等较对照小鼠明显，其中胶原沉积及上皮下纤维化犹为显著。7. KyoT2能下调小鼠肺组织Hes1的表达，减轻OVA诱导的哮喘模型小鼠气道上皮下胶原沉积、减轻基底膜的增厚；此外，还可抑制哮喘气道平滑肌增生等气道重塑现象。8. KyoT2抑制了OVA诱导哮喘模型小鼠的气道高反应性。综合上述，本课题得出的结论为：1. Notch信号通路以Hes1依赖方式直接调控成纤维细胞表达Col1α1和Col1α2。2. Hes1在Notch信号通路调控成纤维细胞表达Col1α1和Col1α2时从传统的具有负性调节特征的因子转换为具有正性调节特征的因子。3.抑制Notch信号通路能改善哮喘小鼠气道上皮下纤维化，降低气道高反应，可能成为治疗哮喘的新靶点。