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摘要：猪胸膜肺炎放线杆菌（actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP），给养猪业带来了巨大的经济损失。大量研究工作证实，APP的外膜脂蛋白（outer membrane lipoprotein，OML）具有较好的免疫原性，在PCP的免疫预防中起着重要作用。本实验参考已发表的APP OML基因序列，设计合成引物，通过PCR方法，将APP QH-1、HN-7菌株的OML基因克隆到pMD18-T载体中，构建重组质粒AppOml-1和AppOml-7并进行序列测定分析。结果表明，QH-1株OML基因的核苷酸序列与参考菌株1、9、11、12血清型的同源性高达99.1%以上，HN-7株OML基因的核苷酸序列与参考菌株3、4、6、7血清型的同源性高达97.3%以上，而与其它血清型参考菌株的同源性较低。对OML基因进行序列分析发现，在其开放阅读框架（open reading frame，ORF）两端存在种间保守序列。据此设计一对特异性引物，经PCR扩增，APP1~10血清型标准菌株均能扩增出大小为980 bp的DNA片段，而对其它具有类似症状的猪呼吸道病原菌扩增结果均为阴性。检测APP DNA的最低浓度为2 pg/mL。将临床分离的6株APP进行PCR检测，均为阳性，与病原学鉴定的符合率为100％。由此证实，此方法可以进行APP的快速检测。利用PCR技术从重组质粒AppOml-1中扩增出包含完整ORF的cAppOML-1基因，用EcoRⅠ、PstⅠ双酶切cAppOML-1基因片段，定向亚克隆到经同样酶切处理的带有6个组氨酸标签的表达载体pPRoEX HTb中，构建重组质粒pPRocAppOml-1，转入大肠杆菌BL21，对阳性克隆测序确认阅读框正确后，用IPTG进行诱导，收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳，对表达蛋白进行Western-blot分析。结果表明，cAppOml-1基因在大肠杆菌中能成功表达，表达蛋白的分子量约为45 ku，扫描分析含量在25％左右。表达产物为融合蛋白，能被猪传染性胸膜肺炎阳性血清所识别。