目的本研究旨在探讨ASK1(Apoptosis signal-regulating kinase 1)在肺癌细胞增殖和迁移信号传导中的作用,并揭示其调控机制,为开拓新的肺癌分子靶点奠定理论基础,为肺癌的临床诊断和治疗提供新思路。方法1、采用慢病毒表达系统在肺癌A549和H1975细胞株中稳定过表达ASK1野生型(ASK1-WT)和激酶失活突变体(ASK1-KD),并用免疫印迹检测过表达效果;通过细胞计数实验来检测过表达ASK1后,对肺癌细胞增殖能力的影响。2、通过Transwell实验和划痕实验检测过表达ASK1后对肺癌细胞迁移的影响。3、利用p38抑制剂SB203380处理A549细胞,通过细胞计数、Transwell实验和划痕实验,评估p38信号通路在ASK1介导的肺癌细胞增殖和迁移中的作用。4、通过GST pull-down方法检测ASK1是否与YAP和TAZ相互作用。5、采用血清处理肺癌A549和H1975细胞,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测ASK1对YAP/TAZ靶基因CYR61和CTGF的影响;通过免疫荧光检测ASK1对YAP和TAZ核定位的影响。6、采用慢病毒表达系统敲低肺癌A549细胞株中内源性TAZ,并用免疫印迹检测敲低效果;通过细胞计数、Transwell实验和划痕实验检测敲低TAZ后,对肺癌细胞增殖和迁移的影响。结果1、肺癌A549和H1975细胞中稳定过表达ASK1-WT显著抑制了细胞的增殖和迁移,而过表达ASK1-KD,细胞的增殖和迁移无显著变化。2、p38抑制剂SB203380处理A549细胞后,ASK1对细胞增殖和迁移的抑制作用没有发生改变。3、GST pull-down结果显示,ASK1与YAP和TAZ的WW结构域相互作用。4、实时荧光定量PCR结果显示,在A549和H1975细胞中稳定过表达ASK1-WT后,YAP/TAZ的靶基因CYR61和CTGF m RNA水平显著降低,而过表达ASK1-KD并没有降低CYR61和CTGF m RNA水平。5、免疫印迹结果显示,过表达ASK1-WT显著降低了A549细胞中CYR61蛋白的表达水平,而过表达ASK1-KD对CYR61蛋白的表达水平没有影响。6、免疫荧光结果显示,YAP和TAZ主要定位于肺癌A549和H1975细胞核内,当过表达ASK1-WT后,细胞质TAZ的量显著增加,细胞核TAZ的量显著降低,而过表达ASK1-KD对TAZ的核定位无影响。此外,过表达ASK1-WT和ASK1-KD均不影响YAP的核定位。7、细胞计数、Transwell实验和划痕实验结果显示,稳定敲低TAZ显著抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移。结论1、ASK1在肺癌细胞增殖和迁移中介导了抑制性信号传导,并且该过程依赖于其激酶活性。2、ASK1通过p38信号通路非依赖途径抑制肺癌细胞增殖和迁移。3、ASK1与YAP和TAZ相互作用,并特异性抑制TAZ的转录活性。4、敲低TAZ与过表达ASK1效应一致,均显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移。