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脑卒中也叫脑中风,是神经系统的多发病和常见病,其致残率和死亡率极其高,是当今人类疾病的三大死亡原因之一,约占人类所有疾病的10%。脑卒中大致分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种类型,其中缺血脑卒中大约占85%。其发病机制与遗传、钙离子超载、氧化应激和炎症等因素有关,但是它的具体机制尚不明确。磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4, PDE4)在体内广泛表达,PDE4能特异性水解环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)。第二信使cAMP具有舒张血管平滑肌、扩张血管、促进神经再生、转化异常细胞等的功能,参加增强细胞呼吸链中氧化酶的活性,并改善心肌缺氧等病理过程。而cAMP的降低能引起血管平滑肌细胞的增殖、迁移以及加剧血管受损处的局部炎性反应,促进动脉粥样硬化的形成,增加血管粥样斑块。在正常细胞中PDE4D大约占总活性的60～70%,而当机体发生炎症时,PDE4D占PDE4的总活性更高,约为80%以上。研究发现PDE4D单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)与缺血性卒中的发病密切相关。缺血性脑卒中过程中,细胞内Ca2+超载是引起神经元死亡的一个重要因素。瞬时受体电位阳离子通道1(transient receptor potential channel1, TRPC1)是定位于细胞膜上的一个非选择性阳离子通道,对Ca2+具有高度的通透性,与中枢神经系统关系最为密切。此外,缺血性脑卒中所致神经元坏死与活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生以及炎症反应有关。缺血发生后激活外周血的白细胞和脑内的小胶质细胞,使之分泌大量的一氧化氮(nitrogen monoxide, NO)、活性氧自由基和细胞因子、低氧诱导因子-1αhypoxia inducible factor1α, HIF-1α)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α),以及环氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)等,从而导致脑水肿、出血,最终加剧神经元死亡。硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一个分子量为12kDa,具有高度保守序列的蛋白,活性序列为-Cys-Gly-Pro-Cys-。具有调节细胞内氧化还原状态、清除活性氧自由基、调节转录因子活性、抗细胞凋亡及神经营养等的作用。硫氧还蛋白结合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2, TBP-2)是Trx的负调节子,与细胞的增殖、凋亡、衰老及糖脂代谢等有关。叉头蛋白FOXO3A (Fork head box3A, FOXO3A)是转录因子,调节氧化应激相关基因的转录。本课题通过构建小鼠的脑缺血中脑动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO),使其缺血2h,收集小鼠脑缺血模型中外周血和皮层组织,利用实时荧光定量PCR的方法检测PDE4D、Trx、TBP-2、CREB、FOXO3A、TRPC1、HIF-1α、COX-2、TNF-α mRNA表达。并且进一步比较了缺血性脑卒中患者与正常对照组外周血这些分子的表达。初步探讨了这些因子与缺血性脑卒中发病机理之间的相关性。本文的主要研究结果如下：(1)小鼠脑缺血2h以后,PDE4D在皮层中的表达明显升高,在血液中没有明显变化；CREB不管是在血液还是皮层中都没有显著变化。表明小鼠急性脑缺血时,皮层中的PDE4D上调,从而降低cAMP活性,进而引起血管平滑肌细胞的增值、迁移以及加剧血管受损处的局部炎性反应,促进动脉粥样硬化的形成和增加血管粥样斑块的不稳定性,最终加重小鼠脑缺血。而在缺血性卒中患者外周血中检测到PDE4D的表达水平明显降低,CREB明显升高。表明PDE4D的降低,使得cAMP的水平相对增高,从而增加了抗炎活性和减少了血管平滑肌的增殖。因此,提示PDE4D表达水平的下降或功能的抑制对缺血性脑卒中患者具有保护作用。PDE4D在小鼠模型和患者中变化不一致,在将来的研究中进一步探讨。(2) TRPC1mRNA在小鼠脑缺血模型的外周血、皮层中和缺血性脑卒中患者外周血中的表达均升高。表明脑缺血发生后,Ca2+内流,导致细胞内Ca2+超载,引起神经元死亡的过程,可能是由TRPC1受体表达增高介导的。TRPC1在小鼠模型和患者中变化一致,是研究脑缺血的一个靶点。(3)Trx RNA在小鼠脑缺血模型的外周血、皮层中表达显著升高。而TBP-2、FOXO3A没有显著变化。在缺血性脑卒中患者外周血中检测到Trx-1和转录因子FOX03A mRNA表达显著升高,TBP-2显著降低。Trx表达增加,表明脑缺血性发生时体内发生了氧化应激,Trx在小鼠模型和患者中变化一致,因此,是很好的脑缺血研究的靶点。(4) HIF-1α表达在小鼠外周血和皮层中均有增强,TNF-a在血液中的表达明显增高,在皮层中没有明显变化。而COX-2mRNA在皮层中的表达明显增高,在血液中没有明显变化。在缺血性脑卒中患者外周血中检测到HIF-α、COX-2mRNA表达均有增强,TNF-α表达没有显著变化。尽管HIF-α、COX-2mRNA及TNF-α变化不完全一致,但仍表明缺血性脑卒中患者体内发生缺氧和炎症反应,HIF-1α和COX-2也可作为评价脑缺血的分子。总结：本研究比较了小鼠脑缺血模型的外周血和皮层中,以及脑缺血患者血液中PDE4D、Trx、TBP-2、CREB、FOX03A、TRPC1、HIF-1α、COX-2、TNF-α mRNA的表达差异,为脑缺血患者的诊断和治疗提供了基础理论依据。