绿脓杆菌蛋白酶Ⅳ(Ps-Ⅳ)是假单胞菌属绿脓杆菌分泌的一种胞外蛋白酶和致病因子,能特异性水解赖氨酸羧基末端所形成的肽键,而对其他肽键无水解能力,属于赖氨酸特异性蛋白水解酶。能降解许多重要的生物活性蛋白,如纤维蛋白原、纤溶酶原、补体蛋白C3、补体蛋白Clq和免疫球蛋白G等。本文主要通过将实验获得的Ps-Ⅳ成熟肽基因克隆至合适的表达载体,以获得其活性表达。首先以绿脓杆菌CMCC(B)10104菌株为考察对象,对其培养液进行赖氨酸特异性蛋白水解酶活性分析,结果表明绿脓杆菌CMCC(B)10104可能分泌蛋白酶Ⅳ。实验提取了绿脓杆菌CMCC(B)10104基因组DNA,以文献报道的其它绿脓杆菌菌株分泌的Ps-Ⅳ基因序列为基础合成引物,PCR扩增得到Ps-Ⅳ成熟肽基因,克隆至载体pGM-T中进行测序,结果表明,与其它不同来源的Ps-Ⅳ基因序列具有很高同源性。将Ps-Ⅳ克隆至载体pET-28a中,构建质粒pET-28a-Tag(his)-Ps-Ⅳ,通过质粒测序验证,证明Ps-Ⅳ基因序列无突变,插入位点正确。运用E.coli BL21对pET-28a-Tag(his)-Ps-Ⅳ进行表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白得到表达,但主要以包涵体形式存在。将Tag(his)-Ps-Ⅳ重新克隆至表达载体pNJUTRX中,构建质粒pNJUTRX-Tag(his)-Ps-Ⅳ,通过质粒测序验证,证明Ps-Ⅳ基因序列无突变,插入位点正确。运用E.coli BL21对pNJUTRX-Tag(his)-Ps-Ⅳ进行表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白得到表达,可溶性表达不低于50%。通过正交试验对表达条件进行初步考察,结果表明,加入IPTG后培养时间对可溶性重组蛋白表达量有较大影响,而IPTG终浓度和培养温度无明显影响。利用金属螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,从表达系统pNJUTRX-Tag(his)-Ps-Ⅳ/E.coli BL21的表达产物中纯化得到电泳纯Ps-Ⅳ。酶活测定表明得到的Ps-Ⅳ具有赖氨酸特异性蛋白水解酶活性,1L发酵液得到Ps-Ⅳ蛋白0.12毫克,为0.25个酶活单位。