研究背景与目的：　　 漫长的生物进化过程中,为了适应自然界周而复始的周期变化,生物体从单细胞到高等动植物以及人类的所有生命活动均形成按照一定规律运行的、周期性的生命活动现象,即生物节律。研究发现生物钟系统的存在,不仅产生和调节生物节律,以适应外界环境的影响和作用,它还是继神经、体液和免疫系统之后又一机体重要的调控系统。大量的研究表明,生物节律紊乱会引起各种疾病的发生。生物节律与肿瘤的发生发展有着密切的联系:生物节律的紊乱会导致肿瘤的发生率增高,促进肿瘤的生长。　　 生物钟基因(Circadian clock gene)调控着机体的生物节律,它是由一组能够通过自身的表达调控和形成正负反馈通路而产生生物节律的基因。目前已知的生物钟基因有:Per(Per1、Per2、Per3)、Bmal1、Clock、Cry(Cry1、Cry2)、CKIε基因等。生物钟基因不仅调控生物节律的变化,同时与维持机体内环境的稳定有关,从而可能影响肿瘤发生发展。　　 本课题拟研究的Bmal1基因是哺乳动物生物钟的核心组件,编码蛋白质Bmal1,它与Clock同属于bHLH-PAS结构域转录因子家族,在反馈回路中起正调控作用。Bmal1/Clock二聚体与E-box相结合,从而对Per、Cry、Rev—Erbα起正调控作用,维持着机体正常的生物节律。　　 生物钟基因与肿瘤之间的关系近年来也逐步受到重视。其中对Per1、Per2研究较多,而Bmal1开始受到关注。Mullenders等研究发现在抑制Bmal1的表达的情况下,人成纤维细胞在受到γ射线照射后,p21蛋白表达下调,这是由于Bmal1沉默后p53激活其靶点p21的功能受到了抑制。但是另一项研究却发现相反的情况,Bmal1基因敲除小鼠的正常肝细胞的p21基因呈失节律性的高表达。Matsuo等的研究显示,在Clock基因突变小鼠,wee1的表达下调,并进一步证明Clock只有与Bmal1形成二聚体后才可以激活Wee1,进而可能影响细胞周期调控。Bmal1基因敲除小鼠和Clock基因突变小鼠对抗癌药物——环磷酰胺的毒副反应明显增强,小鼠的体重均比对照组呈明显下降。但有关Bmal1的研究尚较欠缺,而且不全面,现有的资料尚不能明确Bmal1在肿瘤发生发展过程中到底起何种作用；另外Bmal1的畸变或缺失对抗癌药物作用产生何种影响,也值得深入探讨。　　 本课题试图探讨作为主要生物钟基因的Bmal1在肿瘤生长中的作用,并研究其对抗癌药物作用的影响及其机制。希望以此了解钟基因,钟控基因和钟相关基因的调控及与抗癌药物治疗的关系。　　 方法与结果：　　 1.沉默Bmal1基因的小鼠结肠癌C26细胞株的建立　　 方法:构建靶向于Bmal1的RNAi质粒,慢病毒包装,感染C26细胞,流式细胞仪分选阳性细胞,RT-PCR、Western blot检测细胞Bmal1干扰效果。　　 结果:RT-PCR结果发现的C26_Bmal1 shRNA细胞的Bmal1 mRNA水平明显抑制,而只转染慢病毒空载体C26_Control shRNA细胞Bmal1的mRNA水平没有改变。Western Blot结果也显示C26_Bmall shRNA细胞的Bmal1蛋白水平明显抑制,而C26_Control shRNA细胞的Bmal1蛋白水平没有改变。　　 2.沉默Bmal1对细胞生长的影响　　 2.1沉默Bmal1在体外对细胞生长的影响　　 方法:取对数生长期C26细胞、小鼠成纤维L929细胞以及小鼠原代小肠上皮细胞,绘制生长曲线。　　 结果:　　 1)C26细胞生长明显加快。在细胞生长96h时,C26 Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA的OD值分别为0.78±0.16和1.18±0.03(均值±SD),Bmal1shRNA细胞较对照细胞生长加快51.28％(p<0.05)；在细胞生长120h时,上述两株细胞的OD值分别为0.76±0.15和1.00±0.13,Bmal1 shRNA细胞较对照细胞生长加快28.39％(p<0.05)。　　 2)原代肠上皮细胞生长明显加快。在细胞生长96h时,转染Control siRNA和Bmal1 siRNA肠上皮细胞的OD值分别为1.36±0.23和1.60±0.32(均值±SD),Bmal1 siRNA细胞较对照细胞生长加快17.62％(p<0.05)；在细胞生长120h时,上述两株细胞的OD值分别为0.83±0.12和1.10±0.15,Bmal1 siRNA细胞较对照细胞生长加快36.36％(p<0.05)。　　 3)L929细胞生长明显加快。在细胞生长96h时,转染Control siRNA和Bmal1siRNA的L929细胞的OD值分别为1.42±0.21和1.84±0.17(均值±SD),Bmal1siRNA细胞较对照细胞生长加快29.85％(p<0.05)。　　 2.2沉默Bmal1在体内对细胞生长的影响　　 方法:将相同数目(2×106)的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA种植到BALB/c小鼠腋下,待肿瘤长出后每3天测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。接种肿瘤约30天后处死小鼠,取肿瘤,称瘤重；取小鼠胸腺和脾脏,称重。　　 结果:比较两组小鼠肿瘤的大小,发现C26_Bmal1 shRNA组小鼠较对照组生长明显增快。肿瘤重量较对照组明显增大,Control shRNA与Bmal1 shRNA组的瘤重分别为1.10±0.28和2.24±0.69克。接种Bmal1 shRNA细胞的小鼠的胸腺指数较对照组明显降低,有统计学差异(p<0.05)。　　 3.沉默Bmal1对抗肿瘤药物作用的影响　　 方法:取对数生长期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA细胞,分别加入不同浓度的Docetaxel(DOC)和依托泊苷(VP-16),培养72h后,MTT法检测细胞活性。　　 结果:应用DOC和VP-16后,沉默Bmal1的细胞较对照组细胞的IC50分别明显升高159.3％和69.3％,有统计学差异(p<0.05)。　　 4.沉默Bmal1对细胞凋亡的影响　　 4.1沉默Bmal1对C26细胞凋亡的影响　　 方法:取对数生长期的C26_Control shRNA和C26_Bmal1 shRNA细胞,应用PI/annexinⅤ双染法检测细胞凋亡。　　 结果:对照组细胞凋亡率为3.1±0.2％,Bmal1沉默后细胞凋亡率为4.9±0.3％；应用可诱导细胞凋亡的抗癌药物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,检测细胞凋亡,结果发现C26_Control shRNA的凋亡率分别为24.6±7.5％、29.4±7.1％,而C26_Bmal1 shRNA的凋亡率分别为9.0±3.5％、11.2±5.3％,Bmal1沉默后细胞凋亡明显减少,与对照组细胞C26_Control shRNA相比有统计学差异(p<0.05)。　　 4.2沉默Bmal1对L929细胞凋亡的影响　　 方法:取对数生长期的L929细胞,利用脂质体介导siRNA转染法沉默Bmal1基因,应用PI/annexinⅤ双染法检测细胞凋亡。　　 结果:对照组和Bmal1沉默组的细胞凋亡率分别为15.9±1.8％、7.1±0.7％；应用可诱导细胞凋亡的抗癌药物VP-16,75μM和150μM作用24hr后,检测细胞凋亡,结果发现L929_Control siRNA的凋亡率分别为34.8±8.6％、39.9±7.2％,而L929_Bmal1 siRNA的凋亡率分别为11.3±3.3％、18.5±4.6％,Bmal1沉默后细胞凋亡明显减少,有统计学差异(p<0.05)。　　 5.沉默Bmal1对细胞周期的影响　　 5.1沉默Bmal1对C26细胞周期的影响　　 方法:取对数生长期的C26细胞,利用脂质体介导siRNA转染法沉默Bmal1基因,应用PI染色法检测细胞周期分布。在上述实验的基础上,我们应用细胞周期特异性药物DOC,1μM、5μM作用于C26_Bmal1 shRNA细胞与C26_ControlshRNA细胞48hr后,诱导细胞阻滞于G2/M期,应用Pl染色法检测细胞周期分布。　　 结果:siRNA转染法沉默Bmal1的C26细胞与对照组相比在G2/M期的分布降低约28.2％。C26_Bmal1 shRNA细胞与C26_Control shRNA细胞相比,不用药组、DOC1μM组与DOC5μM组分别下降39.3％、25.1％和11.7％,均有统计学差异(p<0.05)。　　 5.2沉默Bmal1对L929细胞周期的影响　　 方法:取对数生长期的L929细胞,利用脂质体介导siRNA转染法沉默Bmal1基因,应用细胞周期特异性药物DOC,2.5μM、5μM作用48hr后,诱导细胞阻滞于G2/M期,应用PI染色法检测细胞周期分布。　　 结果:Bmal1沉默细胞与对照组细胞相比,不用药组、DOC2.5μM组与DOC5μM组分别下降19.8％、7.6％和8.7％,均有统计学差异(p<0.05)。　　 6.沉默Bmal1基因对细胞DNA损伤修复的影响　　 分别对C26细胞和L929细胞用顺铂处理24hr后,收集细胞,进行单细胞凝胶电泳,荧光显微镜观察,拍照,计数。利用CometScore分析软件分析实验结果,统计DNA尾部百分含量(Tail DNA％,TD)和Olive尾矩(Olive tail momem,OTM)。　　 实验发现沉默Bmal1后,细胞的TD和OTM较对照组明显减少,显示DNA损伤明显减少。　　 7.沉默Bmal1对生物钟基因、细胞周期与凋亡调节基因表达的影响　　 7.1沉默Bmal1基因对C26细胞生物钟基因、细胞周期与凋亡调节基因表达的影响　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR结果显示,生物钟基因per1、per2、per3基因表达下调,cry1表达上调,rev-erbα表达没有明显变化；细胞周期与凋亡调节基因wee1、p53、p21表达下调；c-myc表达没有明显变化。　　 7.2沉默Bmal1基因对小鼠原代肠上皮细胞生物钟基因、细胞周期与凋亡调节基因表达的影响　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR结果显示,生物钟基因per1、per2、per3基因表达下调,cry1、rev-erbα表达上调；细胞周期与凋亡调节基因wee1、p53表达下调；p21、c-myc表达上调。　　 7.3沉默Bmal1基因对L929细胞生物钟基因、细胞周期与凋亡调节基因表达的影响　　 沉默Bmal1基因后,RT-PCR结果显示,生物钟基因per1、per2、per3基因表达下调,cry1表达上调,rev-erbα表达没有明显变化；细胞周期与凋亡调节基因wee1、p53、p21表达下调；c-myc表达没有明显变化。　　 8.沉默Bmal1对细胞周期调节蛋白表达的影响　　 沉默Bmal1基因后,Western blot结果显示,在C26细胞和L929细胞中,CDC2、cyclin B1、cyclin D1、cyclinE的表达上调,而wee1、cyclinA表达没有明显变化。　　 结论：　　 (1)用RNAi法沉默生物钟基因Bmal1后,在体外可以促进小鼠结肠癌细胞C26、小鼠成纤维细胞L929以及小鼠原代肠上皮细胞的增殖；在荷小鼠结肠癌C26小鼠中可以促进肿瘤的生长。　　 (2)在C26、L929细胞沉默Bmal1基因后,通过下调生物钟基因per1、per2、per3和抑癌基因p53、p21的表达,使抗癌药物VP-16诱导的细胞凋亡减少。　　 (3)沉默Bmal1基因后,通过上调cdc2、cyclin B1、cyclinD1、cyclinE导致C26、L929细胞增殖加快,G2/M期分布减少；在应用G2/M期阻滞药Docetaxel后,G2/M期阻滞明显减少。　　 (4)在C26、L929细胞沉默Bmal1基因后,由抗癌药物顺铂(DDP)诱导的细胞DNA损伤明显减少。　　 (5)生物钟基因Bmal1参与了肿瘤凋亡,细胞周期和DNA损伤等生物过程的调控,在维持机体内环境稳定中起重要的作用,Bmal1一旦被沉默或敲除,促进了肿瘤的发生发展,并影响抗癌药物的作用。