RNAi技术研究RAB5A对人肺腺癌细胞的生物学影响及其机制

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liu605199097
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肿瘤转移基因与转移抑制基因的分离和克隆已经成为肿瘤分子生物学研究的另一热点。本研究通过采用RNAi技术沉默RAB5A的表达后,进一步探讨了RAB5A促进肿瘤细胞侵袭和转移的可能机制。 参照Mfold软件预测RAB5AmRNA二级结构,针对不同位点设计并构建了多个siRNA表达载体。瞬时转染RAB5A高表达的、具有高转移潜能的人肺腺癌细胞系Anip973后,通过RT-PCR和western-blot方法分析各siRNA对RAB5A的沉默效应。结果表明,针对软件预测的最可及位点设计的siRNA可以特异性沉默RAB5A蛋白表达,其中R74是siRNA沉默RAB5A的最佳作用靶点。而针对软件分析的不可及位点设计的siRNA则完全没有活性。 将沉默效应最强的siRNA-R74表达载体稳定转染Anip973细胞后,MTT和流式细胞仪技术分析结果表明,Anip973siRNA-R74细胞的生长速度明显减慢,细胞出现Go-G1期阻滞;重组基底膜侵袭能力、趋化运动能力测定结果表明,Anip973siRNA-R74细胞的侵袭及趋化运动能力显著降低。 扫描电镜和共聚焦激光显微镜观察结果显示,Anip973siRNA-R74细胞的微丝结构出现了明显的改变:细胞周边由微丝为主体构成的微绒毛明显增多,且在细胞周边均匀分布;细胞内成束的张力纤维减少;细胞形态变圆,极性丧失。这一表型改变恰好与低转移细胞系AGZY83-a十分相似。为了进一步探讨RAB5A影响微丝结构的机制,本文还采用GSTpull-downassay分析微丝组装调控因子Rac1活性的改变,结果显示,Anip973siRNA-R74细胞中Rac1的活性明显降低。 本研究结果表明,MFold软件分析的RAB5AmRNA二级结构可以作为分析和寻找可及位点的有效工具,siRNAs的作用效率与RAB5AmRNA靶位点密切相关。RAB5A能促进肿瘤细胞的生长,增强其转移和侵袭能力。RAB5A高表达能够改变Anip973细胞微丝的形态和结构,是Anip973细胞高转移能力获得的重要机制。而且,RAB5A对微丝组装的调控作用与Rac1活性改变有关,并由此而影响到细胞的侵袭和转移。
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