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橡胶树是重要的能源作物。橡胶树白粉病是橡胶树生产中重要叶部病害之一。抗病育种是防治植物病害的有效手段之一,基因修饰技术(CRISPR/Cas9,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated endonuclease)可以实现对寄主植物的负调控抗病性基因进行失活,从而培育抗病品种。因此,克隆获得橡胶树对白粉病的负调控抗病性基因是其前提,以及构建CRISPR/Cas9技术应用所需载体是培育抗病转基因植株的关键。本研究基于白粉病抗病性负调控基因研究基础,克隆橡胶树中同源基因Mlo,了解其在病原菌侵染过程中的表达情况,并构建所需载体,尝试以拟南芥感橡胶树白粉菌突变体pad4为靶标,通过CRISPR/Cas9技术以期得到拟南芥转AtMlo2基因植株,该基因与橡胶中HbMlo2基因是同源基因,为后期通过CRISPR/Cas9技术培养橡胶树抗白粉病品系做出铺垫。本研究主要结果如下:1、通过分段克隆法获得HbMlo2基因全长。对该基因序列分析显示,HbMlo2基因DNA序列长度为3435bp,基因cDNA序列长度为1725bp,编码574个氨基酸,与巴西橡胶树的MLO family protein蛋白(AQX37913.1)同源率达98%。通过生物信息学分析HbMlo2基因编码的蛋白14～516aa具有典型的Mlo superfamily保守结构域,8个跨膜结构,没有信号肽。2、用橡胶树白粉菌接种古铜期橡胶叶片上,分别培养至病级指数达到0、1、2、3、4、5级提取RNA。经过荧光定量PCR的方法分析在白粉菌侵染叶片致病的过程中HbMlo2基因表达量的变化。结果表明HbMlo2基因是上调基因,在不同时间的相对表达量具有先升后降的趋势,为负调控抗病性基因。3、经过对抗白粉病负调控基因的筛选,选用Mlo2、EDR1和LFG三个负抗病基因,针对拟南芥中三个同源基因AtMlo2、AtEDR1、AtLFG,设计并合成三段sgRNA/crRNA序列,经过酶切验证成功合成含有三基因AtMlo2/EDR1/LFG sgRNA/crRNA片段的载体pRD278,且内部设计有HindⅢ、SmaⅠ和XbaⅠ单一酶切位点。以pGEM-3Zf(+)为基本骨架成功设计了内部含有HindⅢ、.SmaⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ单一酶切位点的CRISPR/Cas9载体pRD216。4、通过限制性核酸内切酶将pRD278线性化,依据该段单一酶切位点,成功获得AtMlo2 sgRNA/crRNA、AtMlo2/EDR1sgRNA/crRNA、AtEDR1/LFGsgRNA/crRNA、AtMlo2/EDR1/LFGsgRNA/crRNA四部分sgRNA/crRNA片段。利用酶切、连接等基因重组技术分别将四段sgRNA/crRNA序列重组到CRISPR/Cas9载体pRD216中,分别获得4个载体,即单基因AtMlo2 sgRNA/crRNA载体pRD286,双基因AtMlo2/EDR1 sgRNA/crRNA 载体 pRD287、双基因AtEDR1/LFG sgRNA/crRNA 载体 pRD288 和三基因AtMlo2/EDR1/LFG sgRNA/crRNA 载体 pRD280,为开展 CRISPR/Cas9 技术修饰抗病负调控基因奠定了基础。5、分别将pRD280、pRD286、pRD287和pRD288亚克隆入植物双元表达载体pCAMBIA1300相应酶切位点,经过双酶切、PCR等方法验证,成功获得pRD309、pRD310、pRD313和pRD314四个CRISPR/Cas9植物表达重组载体。本研究成功构建四个拟南芥CRISPR/Cas9遗传转化载体,为后续植物遗传转化研究做好铺垫工作。6、我们选用单基因AtMlo2修饰载体pRD310和三基因AtMlo2/EDR1/LFG修饰载体pRD309作为植物转基因载体,将载体分别转入农杆菌EHA105,利用农杆菌介导转化法侵染拟南芥花序,通过潮霉素筛选及PCR验证,获得含单基因AtMlo2修饰载体pRD310的T0和T1代阳性转化子2株,获得含三基因AtMlo2/EDR1/LFG修饰载体pRD309的TO代种子,但经过潮霉素的筛选发现其不萌发。