研究背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,其中卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer, EOC)的发生率在卵巢恶性肿瘤中占80%以上。EOC晚期患者接受多种方案联合治疗,包括理想的肿瘤细胞减灭术,术后联合铂类+紫杉醇类药物化疗已被认为是一线的治疗方案,而铂类耐药是影响预后的主要因素之一。因此,深入了解EOC的耐药机制,改善EOC的化疗耐药,提高EOC的疗效是目前临床亟待解决的难题。目前的研究发现铂耐药的可能机制包括：①减少铂类药物的吸收或增加铂类药物的排出；②增加铂类药物的代谢或是使铂类药物失活；③加速修复铂类药物引起的DNA损伤。在人类细胞中,由化学药物造成的DNA损伤主要通过核苷酸修复(nucleotide excision repair, NER)途径进行修复,其中切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing, ERCC1)在修复过程中起着关键作用。ERCC1是一种高度保守的单链DNA核酸内切酶,在核酸损伤修复和凋亡过程中起着重要作用,其正常表达是维持该修复酶功能的重要分子基础。近年来的研究认为ERCC1与铂类耐药密切相关。在卵巢癌的研究中,有学者在Medline、Pubmed、Web of science和CNKI数据中搜索关于ERCC1表达与卵巢癌铂类化疗反应的文章进行Meta分析,提示ERCC1表达与铂类耐药显著相关。但同时,也有学者在评估ERCC1表达与卵巢癌临床症状、铂反应、进展期或生存期的关系时,提出初始卵巢癌患者ERCC1表达与铂耐药无显著相关；在晚期卵巢癌患者治疗前检测ERCC1与其预后无关。目前ERCC1与卵巢癌铂类耐药及预后之间的相关性存在争议,且大部分研究侧重于临床数据分析,体外细胞水平实验及分子机制的研究少见报道。本课题的研究目的是通过分析ERCC1表达与EOC患者临床病理参数、铂化疗和临床预后的关系,评估ERCC1在EOC患者铂类化疗及预后中的价值。在卵巢上皮癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP及其亲本细胞株SKOV3中检测ERCC1 mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证DDP对ERCC1表达的影响。采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建ERCC1稳定沉默细胞株,通过慢病毒载体介导在细胞水平观察ERCC1基因沉默前后卵巢上皮癌细胞对顺铂的耐药性、细胞增殖及凋亡等的影响,探讨ERCC1在EOC铂类化疗耐药中的分子机制,评价ERCC1能否作为EOC铂类化疗敏感性指标及预后预测指标,为EOC铂类化疗耐药提供临床及实验依据,为EOC耐药提供新的治疗靶点。第一部分ERCC1在卵巢上皮癌患者组织中的表达,与临床病理参数、铂类化疗耐药及预后的相关性分析目的：通过检测ERCC1蛋白在EOC患者组织中的表达,探讨ERCC1蛋白表达与EOC患者临床病理特征、铂类化疗中的意义及与临床预后的关系。材料与方法：1、一般资料：选择2008年1月至2013年12月在广州医科大学附属第一医院住院治疗的92例EOC患者的存档蜡块作为研究对象,所有患者均未行新辅助化疗,均行卵巢癌全面分期手术或满意/较满意的肿瘤细胞减灭术(切除干净/基本切除／大部切除),术后辅以化疗。化疗方案为紫杉醇175 mg/m2+顺铂75 mg/m2(或卡铂按AUC 5-7计算),每3周为1个疗程,联合化疗6-8个疗程。经手术与病理检查证实,有完整的临床资料及随诊记录。年龄21-79岁,根据2009年FIGO的临床分期,Ⅰ期29例,Ⅱ9例,Ⅲ期35例,Ⅳ期19例。病理类型：浆液性癌52例,粘液性癌25例,内膜样癌8例,透明细胞癌7例。病理分级：高分化16例,中分化32例,低分化44例。2、方法：采用免疫组化SP法检测92例EOC患者组织中ERCC1蛋白的表达,分析ERCC1蛋白表达与临床病理特征、铂类化疗和预后的关系。化疗疗效评价指标：①化疗敏感：指化疗结束后6个月内无复发,包括血清CA125正常,盆腔检查及影像学检查无新发病灶或原有残留病灶缩小或消失；②临床耐药：指化疗过程中病情进展或化疗后6个月内血清CA125持续阳性(持续升高或下降后又升高),或影像学发现新发病灶。3、随访情况：随访截止日期为2014年6月,随访时间为5-62个月,中位随访时间28个月。卵巢癌手术至疾病复发或死亡的时间定义为疾病无进展生存时间(disease progression-free survival time, PFS),以最早出现者为截止时间。手术日起至死亡或末次随访时间为总生存时间(overall survival, OS)。4、统计学方法：ERCC1蛋白表达在EOC患者临床病理特征分组间及EOC患者铂类化疗耐药性的比较采用person χ2检验分析。Kaplan-Meier生存曲线比较分析生存资料,并进行Log-Rank检验,Cox比例风险回归模型分析患者生存时间的影响因素,计算风险比(HR)及95%CI。P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1、92例EOC患者ERCC1蛋白的阳性表达率为89.13%(82/92)；患者的年龄、病理类型、细胞分化及临床分期在ERCC1蛋白表达组间差异均无统计学意义(P>0.05)；铂耐药者ERCC1蛋白高表达率高于敏感者,差异有统计学意义(X2=6.787,P=0.009)。2、92例EOC患者中位PFS 48.0, ERCC1高表达中位PFS 18.0,低表达中位PFS缺失。两种表达的生存时间无统计学差异。(X2=1.148,P=0.248)。中位OS 30.0,ERCC1高表达中位OS 25.0,低表达中位OS 48.0。两种表达的生存时间无统计学差异。(X2=2.001,P=0.157)。3、COX多因素回归分析发现病理分化程度、临床分期是影响本组预后的危险因素(P=0.005；P=0.000)；ERCC1蛋白表达不是影响EOC患者预后的危险因素(P=0.056)。结论：1、ERCC1蛋白在EOC患者组织中存在较高的表达;化疗耐药者ERCC1蛋白阳性表达率高于化疗敏感者,提示ERCC1蛋白的表达与临床含铂化疗方案的敏感性有关,ERCC1蛋白表达可作为EOC患者铂类化疗敏感的预测指标。2、病理分化和临床分期是影响EOC患者预后的危险因素。ERCC1蛋白低表达者PFS及OS与ERCC1蛋白高表达者比较,差异无统计学意义。ERCC1蛋白表达作为EOC患者预后预测指标尚需大样本及分层研究。第二部分ERCC1在人卵巢上皮性癌顺铂敏感株/耐药株SKOV3中的表达目的：1、检测SKOV3/DDP及SKOV3细胞在不同顺铂浓度下细胞增殖、细胞凋亡的变化。2、采用实时荧光定量PCR和免疫印记法分别检测ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3/DDP及SKOV3细胞中的表达差异。方法：1、采用CCK-8法检测在不同顺铂浓度作用下SKOV3/DDP及SKOV3细胞的活性；Annexin V-FITC/PI凋亡双染色法检测顺铂处理前后细胞的凋亡。2、采用实时荧光定量PCR,2-△ CT法进行相对定量分析,以GAPDH为内参基因对上样量进行校正,检钡ERCC1 mRNA在SKOV3/DDP及SKOV3细胞中的表达差异。免疫印记法检测ERCC1蛋白在SKOV3/DDP及SKOV3细胞中的表达差异。3、采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料结果以x±s表示,两组数据使用两独立样本t检验或两因素析因设计的方差分析,并比较交互效性,主效应、单独效应及多重比较。多组数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),并进行方差齐性检验,方差不齐时采用welch检验。多重比较采用LSD法或Dunnett’s法。P<0.05表示差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5统计绘图和SPSS 20.0画图。结果：1、细胞活性检测结果显示不同剂量DDP处理SKOV3及SKOV3/DDP细胞株24小时后,SKOV3的细胞活性低于SKOV3/DDP,两组细胞间活性百分比值差异有显著性意义(F=301.321,P<0.001),不同DDP剂量组间差异有显著性意义(F=158.983,P<0.001),细胞组和剂量组之间存在交互作用(F=28.520,P<0.001)。单独效应：固定DDP剂量进行两组细胞间的比较,结果显示除0剂量外,两组细胞间比较差异均有统计学意义,SKOV3/DDP组均显著大于SKOV3组(P<0.05)；固定细胞组进行不同DDP剂量的比较,结果显示SKOV3/DDP组不同DDP剂量间比较差异有统计学意义(F=33.850,P<0.001)。SKOV3组不同DDP剂量间比较差异有统计学意义(F=153.653,P<0.001) (N=5)。2、对DDP处理前后SKOV3及SKOV3/DDP细胞株的凋亡情况进行了检测,结果显示SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞,两组细胞间细胞凋亡率差异有显著性意义(F=69.272, P<0.001). DDP作用组细胞凋亡率高于无DDP作用组,差异有显著性意义(F=28.068,P<0.001)。两组细胞和有/无DDP作用组之间存在交互作用(F=27.907,P<0.001)。单独效应：固定细胞组进行有/无DDP作用比较,结果显示SKOV3/DDP组间比较差异无统计学意义(P=0.695),提示DDP作用对SKOV3/DDP组细胞凋亡无影响,SKOV3组间比较差异有统计学意义(P<0.001), DDP作用组显著大于无DDP作用组,提示DDP促进SKOV3细胞凋亡。固定DDP作用进行两组细胞间的比较,结果显示两组细胞间无DDP作用比较差异有统计学意义(F=6.295,P=0.036),有DDP作用比较差异有统计学意义(F=85.774,P<0.001),提示无论是否DDP作用,SKOV3细胞凋亡率均高于SK0V3/DDP0 (N=3)3、RT-PCR检测结果显示：SKOV3/DDP与SKOV3相比,ERCC1 mRNA含量增高,差异有统计学意义。t=-9.856,p=0.001,N=3。4、Western印迹法检测结果显示：SKOV3/DDP细胞中ERCC1蛋白的相对表达量高于SKOV3,差异有统计学意义。t=-33.219,p<0.001,N=3。结论：1. SK为OV3/DDP细胞株较SKOV3细胞,对DDP具有明显的耐药性,可进行后续相关的细胞耐药实验。2、ERCC1 mRNA和蛋白因在SKOV3/DDP细胞中的表达明显升高,提示ERCC1基因可能是导致顺铂耐药的因子之一。第三部分ERCC1基因缺陷型细胞株的构建目的：构建ERCC1稳定沉默细胞株并鉴定其干扰效能。方法：1、人工合成3条特异性干扰ERCC1的shRNA片段,定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pLVX-shRNA获得3种ERCC1 shRNA表达载体。2、慢病毒转染法将上述3条质粒转染至SKOV3/DDP细胞,RT-PCR检测ERCCl mRNA的沉默水平,挑选具有最佳沉默效果的质粒,选择最佳稳定沉默ERCC1的细胞株,RT-PCR和免疫印记法检测稳定转染细胞系中ERCC1 mRNA和蛋白的表达。3、采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料结果以x±s表示,两组数据使用两独立样本t检验或两因素析因设计的方差分析,并比较交互效性,主效应、单独效应及多重比较。多组数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),并进行方差齐性检验,方差不齐时采用welch检验。多重比较采用LSD法或Dunnett’s法。P<0.05表示差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5统计绘图。结果：1、3种ERCC1 shRNA表达载体构建成功,RT-PCR结果表明pLVX-ERCC1 shRNA1对ERCC1干扰效果较好,综合考虑shRNAl为基因最佳片段。F=40.354,p<0.001,N=3。2、将shRNAl重组质粒稳定转染至SKOV3/DDP细胞,ERCC1蛋白水平的表达量明显下降,差异有统计学意义。t=4.536,P=0.011,N=3。3、成功筛选出稳定转染的细胞株进行后续实验,并命名为pLVX-ERCC1shRNA1。结论：ERCC1 shRNA表达载体构建成功,获得ERCC1基因稳定沉默的SKOV3/ DDP细胞系。第四部分 慢病毒介导ERCC1基因沉默逆转卵巢上皮癌细胞株顺铂耐药的实验研究目的：研究ERCC1基因沉默对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP耐药性的影响及其可能机制。方法：1、pLVX-shRNA慢病毒转染人卵巢上皮癌铂类耐药细胞株SKOV3/DDP,获得稳定转染细胞系,对照组细胞为SKOV3/DDP-shRNAC,实验组细胞为SKOV3/DDP-shRNAl。 CCK-8法检测不同剂量DDP对对照组细胞和转染后细胞(实验组细胞)细胞活性的影响。2、Annexin V-FITC/PI凋亡双染色法检测DDP作用前后对对照组细胞和转染后细胞(实验组)细胞凋亡的影响。3、流式细胞仪(FCM)检测DDP作用前后对对照组细胞和转染后细胞(实验组)细胞周期的影响。4、采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,计量资料结果以x±s表示,两组数据使用两独立样本t检验或两因素析因设计的方差分析,并比较交互效性,主效应、单独效应及多重比较。多组数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),并进行方差齐性检验,方差不齐时采用welch检验。多重比较采用LSD法或Dunnett’s法。P<0.05表示差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5统计绘图和SPSS 20.0画图。结果：1、析因方差分析不同DDP剂量下对照组和实验组细胞间细胞活性百分比值的结果。两组细胞间细胞活性百分比值差异有显著性意义(F=137.142,P<0.001),不同DDP剂量组间差异有显著性意义(F=141.914,P<0.001),细胞组和剂量组之间存在交互作用(F=10.017,P<0.001)。单独效应：同一DDP剂量进行细胞组间的比较,结果显示除0剂量外,两细胞组间比较差异有统计学意义,对照组均显著大于实验组(P<0.05)；同一细胞组间进行不同DDP剂量的比较,结果显示对照组不同DDP剂量间比较差异有统计学意义(F=46.827,P<0.001),实验组不同DDP剂量组间比较差异有统计学意义(F=102.069,P<0.001),多重比较显示各DDP剂量组间差异除0剂量无统计学差异外,其余剂量组间均有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示,无论是在不同剂量DDP作用还是在同一剂量DDP作用下,实验组细胞对DDP的耐药性明显低于对照组,提示特异性沉默ERCC1能增强SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性。(N=6)。2、细胞凋亡检测结果提示两组细胞间细胞凋亡率差异有显著性意义(F=25.950,P<0.001)。有/无DDP作用组的组间差异有显著性意义(F=35.193,P<0.001)。两组细胞和有/无DDP作用组间存在交互作用(F=35.193,P<0.001)。单独效应：同一细胞组进行有/无DDP作用比较,结果显示对照组间比较差异无统计学意义(P=0.758),实验组间比较差异有统计学意义(P<0.001), DDP作用组显著大于无DDP作用组,即DDP促进实验组细胞凋亡而对对照组细胞的细胞凋亡无影响。有/无DDP作用两组细胞间的比较,结果显示两组细胞在无DDP作用下,组间比较差异无统计学意义(F=0.351,P=0.570),两组细胞在DDP作用下,组间比较差异有统计学意义(F=60.792,P<0.001),提示DDP促进细胞凋亡。(N=3)。上述结果提示特异性沉默ERCC1基因后,DDP能促进SKOV3/DDP细胞的凋亡。3、细胞周期分析结果显示在G1期对照组和实验组细胞,组间比较细胞凋亡率差异有显著性意义(F=161.940,P<0.001),有/无DDP作用组间差异有显著性意义(F=129.940,P<0.001),细胞组和有/无DDP作用组之间存在交互作用(F=48.495,P<0.001)。S期对照组和实验组细胞,组间比较细胞凋亡率差异有显著性意义(F=20.441,P=0.02),有/无DDP作用组组间差异有显著性意义(F=186.402,P<0.001),细胞组和有/无DDP作用组之间存在交互作用(F=12.954,P<0.001)。G2期对照组和实验组细胞,组间比较细胞凋亡率差异有显著性意义(F=335.035,P<001),有/无DDP作用组组间差异有显著性意义(F=52.312,P<0.001),细胞组和有/无DDP作用组之间存在交互作用(F=141.120,P<0.001)。上述结果提示DDP作用于ERCC1稳定沉默细胞后,细胞G1和S期的比例下降,G2期的比例升高,表明ERCC1稳定沉默细胞经DDP处理后会停滞于G2期,说明ERCC1沉默通过阻止细胞进行有丝分裂而抑制细胞增殖。(N=3)。结论：ERCC1基因沉默能有效逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性,增加卵巢上皮癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡,使细胞停滞于G2期,阻止细胞进行有丝分裂,可能为EOC耐药的治疗提供新靶点。