背景:我科着眼于中医药抗肿瘤的研究已有相当长的时间,作为国家中医肿瘤专科医疗中心,从70年代就率先开展了以扶正培本为治则的实验和临床研究,相继研究出健脾益肾颗粒、益肺清化膏等获国家新药证书,重点改善肿瘤患者临床症状,提高肿瘤患者生存质量。虽然应用健脾补肾等扶正方法来治疗恶性肿瘤患者,有助提高其生存质量,延长生存期。但针对恶性肿瘤复发转移方面仍需要进一步挖掘中医中药的作用和价值。肿瘤转移是恶性肿瘤区别良性肿瘤的主要特征之一,也是导致患者癌症相关恶化死亡的首要原因。从90年代开始我科工作重点放到防治肿瘤术后复发转移的研究方面,本研究基于中医的“瘀毒”学说,在之前扶正、清热解毒处方基础之上加入活血化瘀解毒中药,临床应用扶正活血解毒方药治疗晚期乳腺癌患者取得了较好疗效。扶正培本与化瘀解毒兼顾已成为抑制肿瘤复发转移的一个重要治则和研究方向,前期有关的实验研究也不断证实活血解毒中药、方剂对肿瘤转移具有一定的抑制作用。近几年随着对肿瘤干细胞研究以及肿瘤微环境的认识越来越深入,干细胞参与肿瘤微环境与肿瘤转移复发有一定的联系。此外,肿瘤相关的炎症与肿瘤的进展密切相关,尤其是肿瘤浸润的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,前期较多的研究中显示中性粒细胞具有一定抑制癌细胞的作用,目前越来越多证据表明其在复杂肿瘤微环境中具有促肿瘤复发转移的作用,其中多重复杂的分子机制和分子之间具体相关性仍有待进一步的研究论证。本研究就是在前期扶正解毒、干细胞实验研究等基础上,进一步建立乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞以及与中性粒细胞共培养细胞模型分析探讨扶正活血解毒方药抑制肿瘤复发转移的分子机制。方法:培养乳腺癌细胞并进行干细胞的富集分离,采用MTT法检测扶正活血解毒方药藤黄酸中药单体、姜黄素中药单体、贝母素甲中药单体、隐丹参酮中药单体对4T1细胞增殖抑制的情况。建立细胞模型,分别建立乳腺癌(4T1)组、4T1与中性粒细胞共培养(PMNs)组、乳腺癌干细胞(CSLCs)组,CSLCs与PMNS共培养组,对照组为细胞组,实验组为加药组。观察4T1组、CSLCs组、4T1与PMNs共培养组、CSLCs与PMNs共培养组,对肿瘤细胞转移的影响以及相关分子机制;分别建立对照组和药物干预组(藤黄酸组、姜黄素组、贝母素甲组、隐丹参酮组),对照组为细胞模型组,实验组均为加入中药干预。观察活血解毒中药单体对乳腺癌细胞转移的影响以及基于干细胞和中性粒细胞分子机制。检测:培养乳腺癌4T1细胞、乳腺癌干细胞、血液提取中性粒细胞并进行共培养,Transwell小室检测4T1细胞、4T1干细胞以及与中性粒细胞共培养,各组肿瘤细胞过膜转移细胞数以及扶正活血解毒方药作用乳腺癌细胞的转移细胞数;ELISA方法检测各细胞组、四种药物藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮干预作用肿瘤细胞后上清中相关细胞因子u-PA、VEGF分泌水平;Western blot方法检测各细胞组、扶正活血解毒方药干预作用细胞后的PAI-1、TFPI-2的蛋白表达情况。结果:1扶正活血解毒药物对乳腺癌细胞的增殖抑制作用研究中药单体成分藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮对乳腺癌4T1细胞的增殖抑制作用,研究结果显示在不同的药物浓度作用24h后,4T1细胞的生长受到不同程度抑制,结果呈浓度依赖性如图(1.1-1.4)。根据MTT的结果结合本实验具体情况,贝母素选择60μmol/L作为进一步实验的药物作用浓度;姜黄素选择15μmol/L作为进一步实验的药物作用浓度;藤黄酸选择0.5μmol/L作为进一步实验的药物作用浓度;隐丹参酮选择30μmol/L作为进一步实验的药物作用浓度。2药物对4T1细胞、4T1干细胞及与PMNs共培养对细胞转移能力的作用药物按选择浓度对乳腺癌细胞各处理组进行干预,姜黄素选择15μmol/L作为药物作用浓度;藤黄酸选择0.5μmol/L作为药物作用浓度;贝母素甲选择60μmol/L作为药物作用浓度;隐丹参酮选择30μmol/L作为药物作用浓度。对4T1组、CSLCs组、4T1与PMNs共培养组、CSLCs与PMNs共培养组分别进行transwell细胞迁移实验。将四组细胞组分别加入四种药物进行干预作用24h后,结果显示,在药物作用方面:药物干预组细胞穿过的数目较对照组转移细胞数量减少(P<0.05)。对照组总转移数最多,为514.80,各组平均128.70。姜黄素干预组细胞总转移数最少,为369.40,各组平均92.35。各组转移细胞总数之间比较:空白组>贝母素甲干预组>藤黄酸干预组>隐丹参酮干预组>姜黄素干预组,扶正活血解毒方药藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮均有不同程度抑制乳腺癌细胞转移的作用。在细胞模型方面:乳腺癌4T1组转移平均数117.20;CSLCs组转移平均数为133.40;4T1与PMNs共培养组转移平均数为126.00;CSLCs与PMNs共培养组转移平均数为138.20。各组之间比较:4T1组总转移数最少,CSLCs与PMNs共培养组转移数最多。各细胞模型组间比较:CSLCs与PMNs共培养组>CSLCs组>4T1与PMNs共培养组>4T1组,CSLCs与PMNs共培养组较4T1组增多,P<0.05,结果有统计学差异。CSLCs组较4T1组增多,P<0.05,结果有统计学差异。4T1与PMNs共培养组较4T1组增多,P<0.05,结果有统计学差异。4T1与PMNs共培养组较CSLCs组减少,P>0.05,差异无统计学意义。3药物对4T1细胞、干细胞及共培养条件下肿瘤转移相关分子活性的影响实验结果显示:细胞上清中uPA分子:4T1与PMNs共培养组较4T1组增高(P<0.05),结果有统计学差异。4T1与PMNs共培养组较CSLCs组略有增高,但(P>0.05),结果无统计学差异。CSLCs组较4T1组增高(P<0.05),CSLCs与PMNs共培养组较CSLCs组增高(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs与PMNs共培养组较4T1组增高(P<0.05),结果有统计学差异。药物干预处理组藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮较对照组均降低(P<0.05),结果有统计学差异。细胞上清中VEGF分子;4T1与PMNs共培养组较4T1组增高(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs组较4T1组增高(P<0.05),CSLCs与PMNs共培养组较CSLCs组增高(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs与PMNs共培养组较4T1组增高(P<0.05),结果有统计学差异。药物干预处理组藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮较对照组降低(P<0.05),结果有统计学差异。4活血解毒方药对4T1细胞、干细胞及共培养条件下转移相关蛋白表达的影响实验结果显示:测定提取细胞蛋白中PAI-1的表达:4T1与PMNs共培养组较4T1组表达增高(P<0.05),结果有统计学差异。4T1与PMNs共培养组较CSLCs组略有增高,但(P>0.05),结果无统计学意义。CSLCs组较4T1组增高(P<0.05),CSLCs与PMNs共培养组较CSLCs组增高(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs与PMNs共培养组较4T1组增高(P<0.05),结果有统计学差异。药物干预处理组藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮较对照组蛋白表达降低(P<0.05),结果有统计学差异。测定蛋白中TFPI-2的含量表达:4T1与PMNs共培养组较4T1组降低(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs组较4T1组降低(P<0.05),CSLCs与PMNs共培养组较CSLCs组降低(P<0.05),结果有统计学差异。CSLCs与PMNs共培养组较4T1组降低(P<0.05),结果有统计学差异。药物干预处理组藤黄酸、姜黄素、贝母素甲、隐丹参酮均较对照组增高(P<0.05),结果有统计学差异。结论:干细胞是肿瘤发生转移的先决条件,相比普通乳腺癌细胞具有更强的迁移能力。研究认为干细胞与存在于肿瘤微环境中的中性粒细胞相互作用促使肿瘤细胞发生滚动粘附继而外渗到达远处组织,形成复发转移。研究结果表明基于中医“瘀毒”学说扶正活血解毒方药对肿瘤细胞有一定的抑制增殖作用,抑制肿瘤细胞转移的作用,其作用机制可能与活血解毒方药调节血液粘度,降低细胞因子uPA、VEGF的表达,作用于干细胞,影响中性粒细胞分化,改善肿瘤微环境,降低细胞转移率相关。从蛋白表达结果分析其作用机制可能与扶正活血解毒方药在肿瘤微环境中下调中性粒细胞相关因子IL-8的分泌,促使N2型向N1型转化,降低中性粒细胞的浸润,改善肿瘤微环境,改善血液流动状态,降低PAI-1蛋白表达,提高TFPI-2蛋白表达发挥促肿瘤凋亡,抑制血管生成和肿瘤转移的作用。