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本试验以灰枣为试材,从田间采样建立组培体系,即启动培养、继代培养,并以试管苗叶片为材料分离原生质体,研究了材料预处理对原生质体分离的影响、分离原生质体的所需要的混合酶液种类及浓度、漂浮法收集原生质体时蔗糖的浓度及离心速度、酶解时间以及渗透压调节剂甘露醇的浓度,为以后利用原生质体进行灰枣的遗传转化和原生质体融合,实现品种改良和创造新品种提供技术条件。主要试验结果如下:1.建立了灰枣组培体系,为进行叶片原生质体的分离奠定了基础。(1)大田采样时,外植体灭菌较为困难,先以70%酒精灭菌30s,再以0.1%HgCl2灭菌10-15min后污染率依然高达97.8%,但该类污染最初发生在外植体下端切口处,随着培养时间的延长,逐渐扩大到培养基表面。培养基中添加150mg/L或200mg/L头孢霉素可使污染率降为0;添加链霉素也能降低污染率,但对枣腋芽的萌发有抑制作用,而头孢霉素对腋芽的萌发影响不明显,因此,选择头孢霉素150mg/L为适宜的抗生素种类和浓度。(2)灰枣启动培养中,在培养基MS+ KT 2.0 mg/L + NAA0.1mg/L获得的粗壮枣头数量较多,细弱的二次枝和枣吊较少,为适宜的启动培养基。(3)灰枣的继代培养中,细胞分裂素KT适合壮苗,最适壮苗培养基为MS+ KT2.0 mg/L+ NAA0.3 mg/L,所获得的枣苗长势壮、叶片大、叶深绿,适宜作为进一步研究的材料;6-BA适合增殖,最适增殖培养基为MS+ 6-BA2.0 mg/L + NAA0.3 mg/L,增殖系数最高,为2.7。2.建立了灰枣叶片原生质体分离纯化体系,获得了产量高、活力高的原生质体。(1)在酶解分离原生质体前,以真空处理6min,酶解14h能够获得最高产量,比未经真空处理酶解时间缩短2h,提高了酶解效率。(2)以继代20天左右试管苗顶梢3片完全展开的嫩叶为分离材料,在2.0% Cellulase R-10+0.1 % MacerozymeR-10+0.1 % Pectolase Y-23+0.4 %Driselase酶液中获得原生质体产量最高,为1.1×107个/g·FW,活力85.7%,并且在使用的4种酶中,对原生质体分离影响大小顺序为Driselase>Cellulase R-10>MacerozymeR-10>Pectolase Y-23,Driselase对原生质体的分离起首要作用。(3)漂浮法收集原生质体时,适宜的蔗糖浓度为1.5mol/L,离心速度为2300rpm,蔗糖浓度和离心速度过高或过低都会降低原生质体的产量和活力。(4)以甘露醇作为渗透压调节剂时,适宜的浓度为0.7 mol/L,浓度过高或过低都能显著降低原生质体的产量和活力。