溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,是一种无害、无毒,不会残留在体内的天然蛋白质。其广泛分布于不同生物体中,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶。2007年,本实验室首次分离和鉴定了海参i-型溶菌酶基因,并已在原核细胞和真核细胞中高效表达其目的蛋白。该研究以本实验室已构建的能高效表达的海参i-型溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株,运用发酵罐对该工程菌进行发酵生产。发酵液经过一系列分离纯化后得到海参i-型溶菌酶产品。利用高效液相色谱和MALDI-TOF质谱技术对海参i-型溶菌酶产品进行分析测定,通过利用分子动力学模拟的方法对该酶热稳定性进一步研究。研究结果如下:(1)5 L发酵罐初始为3 L BSM基础盐培养基,发酵过程控制条件为温度30℃,pH6.0,搅拌转速400 r/min,溶解氧DO 30%;发酵过程分为三个阶段,即细胞生长阶段、甘油流加阶段和甲醇诱导产物分泌阶段。发酵结束后,分析该发酵液的溶菌酶产量为58mg/L。最后生产的海参i-型溶菌酶产品,其酶活力为1246 U/mg。高效液相色谱分析结果显示,该溶菌酶产品与蛋清溶菌酶标准品的出峰时间相同,而且无其他杂峰。MALDI-TOF质谱分析结果显示,该海参i-型溶菌酶的分子量为14708.7 Da,与其氨基酸组成的理论计算值相符合,这说明该产品为海参i-型溶菌酶。(2)利用生物信息学方法,对海参i-型溶菌酶蛋白进行分析。通过一级结构分析确定了,海参i-型溶菌酶的氨基酸种类、数量及占比;二级结构预测分析可推断,该溶菌酶蛋白中α-螺旋,β-折叠,β-转角及无规则卷曲的比例及位置。通过三级结构预测可推断该溶菌酶活性中心及活性位点在亚基结构中所处的位置。(3)在酶学性质研究方面,确定海参i-型溶菌酶的最适温度为35℃,在65-80℃较高温度下有较好的热稳定性;最适pH为6.5,pH在5.0-8.0之间稳定性较好。通过分子动力学模拟,发现该溶菌酶的三级结构存在“螺旋-环-螺旋”(HLH),推测该酶的抗菌活性与此结构有关,这个结果与国外学者Zavalova等对水蛭溶菌酶单个螺旋肽形成的HLH构象具有活性的研究结果相符合。进一步分析比较确定该溶菌酶两个活性位点(Glu 19和Asp 31)分别位于“H2-L3-H3”构象中的2个螺旋区域上。“螺旋-环-螺旋”构象在高温下使其仍具有很强的抗菌活性,这表明该酶具有良好的热稳定性,与不同温度下抑菌试验结果相符。这个研究为进一步探讨海参i-型溶菌酶的分子作用机理奠定良好的理论基础,该酶的热稳定性优势对食品工业及动物饲料加工业非常有利,所以它具有很大的应用价值。