蚊是非自育昆虫，雌蚊需要吸取脊椎动物的血液才能产卵。雌蚊的嗜血特性使其频繁接触宿主，从而成为许多疾病的传播媒介，如疟疾、登革热、流行性乙型脑炎、黄热病等，严重威胁人类健康。因此，深入开展蚊虫的生物学特性研究，阐明雌蚊血餐代谢的分子机制，有助于发现新型杀虫剂作用靶标，探索新的蚊虫控制策略。　　 嗜血雌蚊摄入宿主的血液是自身体重的2倍，血餐中含有大量蛋白质，其中60％以上蛋白氨基酸被脱氨基氧化供能，只有3％参与卵蛋白的合成，其它被用于合成卵脂类、自身蛋白和能量储存。食物氨基酸脱氨基过程中产生的氨的代谢平衡对于维持蚊虫正常的生理功能极为重要。而血餐后24小时雌蚊血淋巴内的铵离子浓度仅增加了1.3mM，提示在大规模的脱氨基作用中，雌蚊代谢氨的能力巨大，足以维持血淋巴内的低铵离子浓度。　　 氨在细菌中含量丰富，铵离子通道在植物、微生物摄取和同化氮的过程中起关键作用，使得细菌和酵母能够在氨气存在的情况下存活，并将它作为唯一氮源。酵母和哺乳动物中的铵离子通道家族成员分别为甲铵透酶(methylaminepermeases，Mep)和Rh类糖蛋白(Rhesus-like glycoprotein)。目前已有3个哺乳动物铵离子通道家族成员被分离鉴定：RhAG(Rhesus-associated glycoprotein)；RhBG(Rhesus B glycoprotein)和RhCG(Rhesus C glycoprotein)。然而迄今为止，蚊体内的铵离子通道的同类物还知之甚少。　　 我们对GenBank中各种蚊虫的核酸序列扫描结果显示：冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊均存在Rh类糖蛋白，其氨基酸序列与鼠Rhbg、人RhBG、果蝇Rh50类糖蛋白的一致性为45-77％。生物信息学分析提示：蚊Rh类糖蛋白可能是重要的铵离子通道超家族成员。目前，Rh类糖蛋白在蚊体内的分布、作用及功能位点尚无所知，对这些内容进行全面研究将有助于新型杀虫剂作用靶标的发现。因此，本课题以登革热的重要媒介白纹伊蚊为研究对象，克隆其Rh类糖蛋白(Aedes albopictus Rhesus-like glycoprotein，AaRh)基因的全长cDNA，确定该蛋白的组织分布和作用特性，鉴定蚊类铵离子通道超家族成员。　　 研究方法：　　 1.AaRh全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析　　 1.1应用简并引物RT-PCR获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白的基因片段　　 根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果，我们分别在184/343和219/339氨基酸位点设计2对简并引物，以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板，合成cDNA第一链，应用巢式PCR扩增AaRh的基因片段。　　 1.2应用RACE方法获取AaRh基因的全长cDNA序列　　 根据获得的AaRh基因部分序列，设计2对特异性引物AaRh GSP1、GSP2和AaRh GSP3、GSP4，应用5RACE和3RACE分别扩增AaRh基因的5端和3端cDNA片段，然后拼接出全长cDNA序列。　　 1.3 AaRh核苷酸序列及推测的氨基酸序列生物信息学分析　　 通过NCBI网站的BLASTx程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将目的基因序列与GenBank中的相关序列进行比对，判断该基因是否是全长基因，并推导氨基酸序列。通过蛋白分析专家系统Expasy(http：/www.expasy.org/)所提供的蛋白质序列分析工具：ProtParam程序预测蛋白质的理化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成、在溶液中的稳定性等；PROSITE motif程序预测一级结构中糖基化、脂酰化、磷酸化等修饰位点和模序；SignalP程序分析分泌信号肽特征序列；InterPro Scan程序扫描一级结构中包含的结构和功能域特征序列；SOSUI程序预测AaRh蛋白的跨膜区、拓扑结构等二级结构。通过在线生物信息学软件EMBOSS(http：//bioweb.pasteur.fr/seqanal/EMBOSS)预测线性抗原决定簇和氨基酸的亲水性。利用CLUSTALW程序对白纹伊蚊AaRh与GenBank中其它物种的同源蛋白序列进行比对分析，构建分子进化树。　　 2.AaRh的组织定位和血餐诱导表达分析　　 2.1构建pEGFP-AaRh真核表达质粒，转染Hela细胞　　 根据AaRh mRNA ORF序列，分别在起始密码子后(包括起始密码子)和终止密码子前(不包括终止密码子)设计一对特异性引物，扩增AaRh全长cDNA。通过双酶切真核荧光表达载体pEGFP-N1和AaRh全长cDNA、连接等分子克隆步骤，构建pEGFP-AaRh重组质粒。将pEGFP-AaRh和pEGFP-N1分别转染Hela细胞，24h、48h、72h后在荧光显微镜下观察、照像。　　 2.2白纹伊蚊C6/36细胞内AaRh mRNA的鉴定　　 根据AaRh mRNA全长序列设计茎环结构的分子信标探针，转染白纹伊蚊C6/36细胞，4h后行荧光显微镜观察、照像。　　 2.3AaRh蛋白在白纹伊蚊雌蚊的免疫组织定位　　 根据AaRh氨基酸序列抗原表位预测结果，选取两个可能的抗原表位363-376aa和433-446aa，人工合成两段多肽，分别与载体KLH偶联后免疫家兔制备抗血清。制备白纹伊蚊雌蚊的石蜡切片，通过免疫组化方法确定AaRh蛋白的组织分布。　　 2.4 AaRh基因在蚊各发育阶段及血餐前后的时空表达模式　　 以SYBR Green为荧光染料，AaRh GSP1、GSP2为特异性引物，应用荧光定量RT-PCR确定AaRh基因在蚊虫不同发育阶段(卵、幼虫、蛹)的表达水平；雌蚊不同组织(头、胸、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢)在血餐前后不同时间点的AaRh转录水平。　　 研究结果：　　 1.AaRh基因全长cDNA序列的获得及其生物信息学分析　　 应用2对简并引物进行巢式PCR，获得379bp AaRh基因片段。应用5RACE和3RACE方法，分别获得AaRh基因5端1008 bp、3端822 bp cDNA序列，根据两个片段的首/尾共同序列拼接为1717bp的基因片段。将该核苷酸序列在GenBank中进行BLASTn分析，结果显示AaRh与埃及伊蚊Rh50-GP1、埃及伊蚊Rh抗原、埃及伊蚊Rh50-GP2、致倦库蚊Amt1的核苷酸一致性分别为84％、87％、81％和77％。AaRh基因具有完整的开放阅读框，其ORF从第128位到1516位含1389bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，编码462个氨基酸。在5端和3端分别有127 bp、201 bp的非翻译区。　　 通过在线生物信息学软件分析(Expasy和NCBI)，白纹伊蚊Rh类糖蛋白是一个整合膜蛋白，跨膜11次，58aa-446aa具有铵离子通道的结构功能域；理论等电点(pI)5.37，分子量(Mw)49775.10 Dalton，1aa-26aa可能为分泌信号肽序列；含有4个潜在的天冬酰胺糖基化位点，翻译后可能进行糖基化修饰，提示其为糖蛋白；EMBOSS预测其有17个线性抗原决定簇。同源性分析结果显示白纹伊蚊Rh类糖蛋白与埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高达95％。综合以上分析结果，我们推测AaRh可能是铵离子通道家族的新成员。　　 2.AaRh的组织定位和血餐诱导表达分析　　 成功构建真核表达质粒pEGFP-AaRh，与绿色荧光蛋白融合的重组白纹伊蚊Rh类糖蛋白在Hela细胞的胞膜表达，显示其是膜蛋白。应用分子信标探针鉴定AaRh mRNA在白纹伊蚊C6/36细胞内表达，提示其在蚊胸肌细胞正常代谢活动中的重要性。通过免疫组化方法确定AaRh蛋白主要分布于白纹伊蚊雌蚊的头、胸、脂肪体和马氏管，在中肠、卵巢分布较少。　　 应用荧光定量RT-PCR确定AaRh基因在白纹伊蚊的卵、幼虫、蛹、成蚊各个发育阶段均有较高水平表达；在羽化3天饲糖雌蚊的头和马氏管表达水平最高，其次为胸，在脂肪体、中肠和卵巢表达较少。雌蚊血餐后3h，中肠、脂肪体、马氏管的AaRh mRNA表达水平逐渐增加，胃血消化结束后逐渐下降，恢复至血餐前水平。中肠、脂肪体、马氏管是雌蚊血餐后氨代谢活跃的场所，因此明显提示AaRh蛋白可能是蚊虫铵离子通道家族成员。　　 研究结论：　　 1.我们成功获得白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的全长cDNA序列，通过生物信息学方法预测其理化性质、拓扑学结构、保守功能域等，推测其为铵离子通道家族成员。　　 2.与绿色荧光蛋白融合的重组AaRh蛋白在Hela细胞的胞膜表达，显示其膜蛋白特性。分子信标探针鉴定AaRh mRNA在白纹伊蚊胸肌C6/36活细胞内表达，免疫组化方法确定AaRh蛋白主要分布于白纹伊蚊雌蚊的头、胸、脂肪体和马氏管，在中肠和卵巢分布较少。荧光定量RT-PCR方法确定AaRhmRNA在羽化3天饲糖雌蚊的脑、马氏管含量最高，其次是胸，在脂肪体、中肠和卵巢含量较少。雌蚊血餐后中肠、脂肪体、马氏管的AaRh mRNA表达水平增加，与铵离子通道功能相一致。因此，我们认为白纹伊蚊Rh类糖蛋白很可能是蚊虫铵离子通道家族成员。