论文部分内容阅读
目的:胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是侵袭性最强、最难治愈的恶性肿瘤之一,发病率占原发性中枢神经系统恶性肿瘤的48.5%,严重威胁人类健康。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是治疗GBM的首选化疗药物,然而,其疗效受低效性和耐药性的限制,仅50%的患者可以从TMZ治疗中获益。目前O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）甲基化状态是临床预测GBM患者TMZ治疗敏感性的重要参考指标,但并非所有甲基化患者都对烷基化剂有明显的治疗反应。最近的一项研究提出MGMT基因的甲基化状态只能预测某些具有经典分子改变的GBM患者的TMZ治疗结果。2021年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（第五版）根据不同的驱动基因和分子特征,将胶质母细胞瘤分类重新定义。因此,在新版肿瘤分类的框架下,开发新的诊断及治疗导向标志物,有望为精准靶向治疗提供指引和帮助。自噬是一种保守的细胞分解代谢过程,在维持细胞内环境稳定中发挥重要作用,被认为是应激条件下细胞生存的一种适应性反应,这种应激状态下细胞赖以存活的机制可能为肿瘤治疗提供新的策略。然而,化疗诱导的肿瘤细胞启动保护性自噬的确切机制和潜在的起始因子尚不清楚。本实验组前期研究发现,CEP55参与星形细胞瘤进展,其高表达与星形细胞瘤WHO分级及患者不良预后显著正相关,敲除CEP55可显著提高GBM细胞TMZ敏感性。本研究是在前期研究基础上,以自噬途径为切入点,探索CEP55参与自噬调节,影响TMZ敏感性的机制,为丰富GBM药物抵抗的分子机制、优化GBM分子干预及精准治疗策略奠定研究基础。方法:1.采用qRT-PCR及Western Blot方法检测24例高级别胶质瘤CEP55m RNA和蛋白表达水平。2.体外培养GBM细胞U87和U251细胞株,si RNA干扰技术抑制CEP55的表达,透射电镜观察自噬体数量;Western Blot检测细胞自噬相关蛋白变化;转染m RFP-GFP-LC3双标腺病毒,荧光显微镜检测自噬体和自噬溶酶体的形成。3.体外培养GBM细胞U87和U251细胞株,采用慢病毒感染并筛选稳定过表达CEP55细胞株,Western Blot检测细胞自噬相关蛋白变化。4.利用免疫组织化学方法检测76例（包括IDH野生型GBM 36例及CNS WHO 4级星形细胞瘤,IDH突变型10例）石蜡包埋组织中CEP55、P62及LC3B蛋白的表达,结合肿瘤大小、分子表型等病理特征分析各蛋白表达的临床病理意义;分析CEP55与P62、LC3B表达的相关性;结合患者随访信息,分析蛋白表达在患者预后中的意义。5.si RNA干扰技术抑制U87和U251细胞株CEP55的表达,CCK-8实验和Western Blot检测加入自噬抑制剂3-MA后GBM细胞TMZ敏感性的变化。结果:1.CEP55对胶质母细胞瘤TMZ敏感性的影响1.1高级别胶质瘤患者高表达CEP55检测24例高级别胶质瘤病人的新鲜肿瘤组织标本（IDH野生型GBM17例,CNS WHO 4级星形细胞瘤,IDH突变型1例及间变型星型细胞瘤6例）,以是否MGMT甲基化分组,qRT-PCR结果显示不敏感组和敏感组CEP55 m RNA表达差异无统计学意义（P=0.0569）,但Western Blot结果提示不敏感组CEP55蛋白高表达（P=0.0314）。76例既往诊断GBM石蜡包埋组织中,随机选择40例行MGMT甲基化检测（IDH野生型GBM 30例,CNS WHO 4级星形细胞瘤,IDH突变型10例）,IHC结果显示两种肿瘤CEP55蛋白表达无明显差异（P=0.816）,TMZ不敏感组CEP55蛋白表达明显高于敏感组（P=0.0171）。1.2 CEP55对GBM细胞U87和U251 TMZ敏感性的影响体外培养U87和U251细胞株,转染si-CEP55抑制CEP55表达水平,同时加入200μM TMZ处理细胞,CCK-8检测结果表明,U87细胞敲除CEP55后24h、48h及72h增殖活性均明显低于对照组细胞（P＜0.05）;敲除CEP55后,U251细胞在42h及72h的增殖活性显著低于对照组细胞（P＜0.05）。采用慢病毒颗粒转染U87和U251细胞株,筛选稳定过表达CEP55细胞株。加入200μM TMZ处理细胞,CCK-8检测结果显示,过表达CEP55的U87细胞在48h及72h增殖活性显著高于对照组细胞（P＜0.05）;U251细胞过表达CEP55在72h的增殖活性高于对照组细胞（P=0.0251）。2.CEP55对GBM细胞自噬的影响2.1抑制CEP55提高GBM细胞U87和U251的自噬水平si RNA干扰技术抑制U87细胞CEP55的表达,透射电镜显示与对照组相比,CEP55敲除组细胞产生大量自噬体（P=0.0013）;Western Blot结果显示U87和U251细胞敲除CEP55后,LC3 II的表达升高,P62的表达下降（P＜0.05）。荧光显微镜显示转染m RFP-GFP-LC3双标腺病毒后,抑制CEP55的U87和U251细胞自噬体和自噬溶酶体均明显增加,且自噬溶酶体增加更为显著（P＜0.05）。2.2过表达CEP55抑制GBM细胞U87和U251的自噬水平采用慢病毒颗粒转染U87和U251细胞株,筛选稳定过表达CEP55细胞株。Western Blot结果显示U87和U251细胞过表达CEP55后,LC3II的表达下降,P62的表达升高（P＜0.05）。2.3石蜡包埋组织标本CEP55、LC3B和P62表达情况及临床病理特征相关分析选取76例既往诊断GBM蜡块标本,其中36例为IDH野生型GBM（CNS WHO 4级）,10例为星形细胞瘤,IDH突变型,CNS WHO 4级。IHC结果显示,76例组织中CEP55高表达为36例,IDH野生型GBM组织CEP55高表达为22例,CNS WHO 4级星形细胞瘤,IDH突变型组织CEP55高表达为3例。相关性分析显示76例组织中CEP55和P62的表达呈正相关（r~2=0.3101,P＜0.0001）,CEP55和LC3B表达具有负相关性（r~2=0.1236,P=0.002）,IDH野生型GBM组织中LC3B表达明显低于相对于星形细胞瘤,IDH突变型,WHO 4级（P=0.0237）,P62表达明显高于相对于星形细胞瘤,IDH突变型,WHO 4级（P=0.0491）。Kaplan-Meier生存分析表明,IDH野生型GBM组织中,LC3B高表达组总体存活率高于低表达组（P=0.0023）,P62高表达组总体存活率低于低表达组（P=0.0201）。通过Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析,结果提示,在IDH野生型GBM中,LC3B和P62表达水平为独立的预后因子（P＜0.05）,年龄、性别等其他因素与IDH野生型GBM患者的总生存时间无关。3.CEP55通过调节自噬影响GBM细胞TMZ敏感性体外培养U87和U251细胞株,转染si-CEP55,同时加入自噬抑制剂3-MA,Western Blot结果显示,3-MA有效抑制沉默CEP55后U87和U251细胞自噬水平的升高（P＜0.05）;给予梯度浓度TMZ处理细胞24h,CCK-8检测结果显示,与si-CEP55组相比,加入3-MA后U87和U251细胞增殖活性升高（P＜0.05）。结论:1.相对于星形细胞瘤,IDH突变型,WHO 4级,IDH野生型GBM自噬现象更为显著。2.IDH野生型GBM患者P62高表达与LC3B低表达提示不良预后。3.CEP55可能通过调节自噬影响GBM替莫唑胺敏感性。