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目的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是造成器官纤维化的主要原因,也是大多数白内障的常见发病机制。白内障是最主要的致盲眼病之一,手术治疗可以有效地恢复白内障患者的视力,但后发性白内障(posterior capsular opacification,PCO)等术后并发症可导致患者视力再次下降,严重影响患者术后的视觉质量。2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(2’,3’-cyclic-nucleotide3’-phosphodiesterase,CNPase或CNP)能催化2’,3’-环核苷酸水解为相应的2’-单磷酸腺苷(AMP),随后这些AMP被转化成腺苷,参与嘌呤能信号的转导。已有大量研究证实,嘌呤能信号转导系统能够显著地促进上皮-间质转化的发生和发展,因此,CNPase作为腺苷代谢过程中的一种关键酶,可能在PCO的EMT进展过程中发挥至关重要的作用。本研究旨在探讨CNPase在后发性白内障EMT发生发展过程中的分子机制,为PCO的防治提供新的思路。方法第一部分:体外实验:采用重组人TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞株(SRA 01/04)建立体外EMT模型,运用全转录组测序和生物信息学分析比较模型组与对照组人晶状体上皮细胞的基因表达谱差异,并采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot来验证体外EMT过程中CNPase的动态变化。体内实验:用内径0.26mm的注射针头针刺划伤C57BL/6J小鼠晶状体前囊膜建立前囊膜损伤模型,裂隙灯下观察白内障形成情况,造模第7天取眼球切片,通过HE染色和Masson染色观察模型效果,并于造模后第5、7、14天取眼球切片进行免疫荧光染色观察小鼠晶状体EMT过程中CNPase的动态变化。第二部分:采用si RNA转染敲低CNPase,采用慢病毒转染过表达CNPase。分别观察干扰CNPase和过表达CNPase后对晶状体上皮细胞的影响,实验分组分别为:A1:正常细胞对照组;B1:si RNA转染组;C1:正常细胞+TGF-β2组;D1:si RNA转染+TGF-β2组;A2:正常细胞对照组;B2:慢病毒转染组。采用Transwell迁移实验、划痕实验、Ed U掺入实验、Western blot和免疫荧光染色检测CNPase表达差异对晶状体上皮细胞迁移能力、增殖能力以及上皮-间质转化相关标记物表达水平的影响。第三部分:运用免疫共沉淀、蛋白质谱全谱分析和Western blot,探索人晶状体上皮细胞中CNPase与转胶蛋白2(transgelin 2,TAGLN2)之间的相互作用。采用si RNA干扰CNPase,慢病毒过表达CNPase后,运用Western blot和免疫荧光染色,检测CNPase表达差异对TAGLN2的影响。进一步在过表达CNPase的细胞中转染TAGLN2 si RNA以敲低TAGLN2,采用Transwell迁移实验、划痕实验、Ed U掺入实验、Western blot和免疫荧光染色观察TAGLN2在CNPase过表达介导的上皮-间质转化进程中的作用。第四部分:慢病毒过表达TAGLN2,运用Western blot,免疫荧光染色、Transwell迁移实验、划痕实验和Ed U掺入法观察TAGLN2表达差异对TGF-β/Smad信号通路及上皮-间质转化相关指标的影响。进一步在过表达TAGLN2的细胞中用Smad3抑制剂SIS3处理,运用W estern b lo t,免疫荧光染色、Transwell迁移实验、划痕实验和Ed U掺入法观察Smad3在TAGLN2介导的上皮-间质转化进程中的作用。结果1、小鼠晶状体前囊膜针刺划伤实验结果显示PCO过程中CNPase表达显著升高,其变化趋势与上皮-间质转化相关标记物波形蛋白变化趋势相似。2、过表达CNPase显著促进人晶状体上皮细胞增殖、迁移和上皮-间质转化过程;相反,干扰CNPase能有效地逆转人晶状体上皮细胞增殖、迁移和上皮-间质转化过程。3、CNPase与TAGLN2具有相互作用,且干扰TAGLN2能显著抑制CNPase介导的晶状体上皮-间质转化。4、过表达TAGLN2能显著上调TGF-β/Smad信号通路并促进上皮-间质转化的进展,S mad3特异性抑制剂SIS3能显著抑制TAGLN2对上皮-间质转化的促进作用。结论本研究证实CNPase显著促进晶状体上皮细胞上皮-间质转化过程,且这一促进作用可能是通过与TAGLN2的交互作用靶向调控TGF-β/Smad信号通路而实现的。综上,CNPase可能成为后发性白内障等纤维化疾病新的防治靶点。