miR-410-3p对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生物学行为的调控及机制研究

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目的:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种慢性、系统性自身免疫性疾病,以侵蚀性关节炎和滑膜炎为主要病理特征,主要表现为手足等对称性多关节炎。RA的病理特点为滑膜组织增生、血管翳生成,疾病进展可造成关节破坏和功能丧失,久病程者会有心肺肾等其他脏器受累。RA病程长,迁延不愈,目前现有治疗方案仍有部分患者无法达到疾病缓解,疾病进展到后期致畸致残,严重影响患者的生活质量。RA的病因尚不完全清楚,除公认的遗传、环境因素外,感染、生活习惯等因素均可能参与其中。针对RA的发病机制现有研究已经深入到细胞、分子和基因水平,RA相关致病因素不断被发现,为RA的治疗提供了一些新思路,在一定程度上使患者生活质量得到改善。然而RA的发病机制目前尚未阐明,为寻求靶向治疗RA并达到疾病的完全临床缓解,探究RA的病因尤为重要。既往研究表明,关节滑膜组织过度增生是RA疾病进展的始动环节,在RA发病早期也发挥重要作用,而关节成纤维样滑膜细胞异常生物学行为的改变是造成滑膜组织过度增生的主要原因,主要体现在滑膜细胞的增殖促进和凋亡抑制;而关节微环境内的诸多炎性细胞因子对滑膜细胞的增殖也起到了促进作用,造成持续性的炎症反应。因此,系统地研究参与滑膜细胞的异常生物学行为的调控因素,对于阐明RA的病因、研发更有效的靶向治疗策略有重要价值。近年来,非编码RNA作为众多疾病的研究热点出现在研究者眼前,其中微小RNA是目前研究最多的一类非编码RNA。我们在前期实验中发现miR-410-3p在RA患者滑膜组织中表达下调,提示miR-410-3p可能在RA中发挥一定作用。通过TargetScan等microRNA靶基因网站预测发现转录因子阴阳1(YY1)是miR-410-3p的下游靶基因。目前尚未有YY1与成纤维样滑膜细胞(FLSs)炎性细胞因子分泌、增殖和凋亡的相关报道。本研究拟以此为切入点,深入研究miR-410-3p对滑膜细胞炎性细胞因子分泌、增殖和凋亡的调控,探索miR-410-3p与YY1之间是否存在直接作用结合,以及miR-410-3p调控滑膜细胞生物学行为的内在机制。NF-κB信号转导通路是RA中经典的炎症和增殖相关通路,它主要由TNF-α或IL-1β与细胞膜表面受体结合后诱导活化,其引起的滑膜细胞生物学行为异常是RA疾病进展的重要机制之一。NF-κB信号与TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子之间形成正反馈环路,引起持续性炎症反应,因此针对NF-κB信号转导通路的RA靶向治疗非常有前景。本研究还欲探索miR-410-3p对滑膜细胞中IκBα、p-IκBα和p65、p-p65表达的影响,研究miR-410-3p与NF-κB信号转导通路的关系。研究方法:1.实时荧光定量PCR检测miR-410-3p在RA患者的滑膜组织和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞细胞(HFLS-RA)中mRNA水平的表达;接下来在HFLS-RA细胞系中转染miR-410-3p类似物(mimics)、抑制剂(inhibitor)、各自阴性对照序列及空白组,实时荧光定量PCR检测转染效率,ELISA法检测miR-410-3p对HFLS-RA细胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9四种炎性细胞因子的影响,CCK-8法和流式细胞术检测miR-410-3p对HFLS-RA细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。2.对HFLS-RA细胞进行miR-410-3p类似物及抑制剂等转染,Westem blot检测IκBα、p-IκBα和p65、p-p65的蛋白表达情况;NF-κB活化核移位荧光法检测HFLS-RA细胞转染miR-410-3p后NF-κB的活化情况;对HFLS-RA细胞进行BAY11-7082(NF-κB抑制剂)处理,Westem blot检测p65、p-p65的蛋白表达情况;比较miR-410-3p抑制剂、抑制剂阴性对照及抑制剂+BAY 11-7082三组间HFLS-RA细胞上清液中炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9的表达情况。3.双荧光素酶报告基因系统检测miR-410-3p与下游靶基因YY1是否存在直接结合;构建YY1过表达载体,对HFLS-RA细胞进行转染,定量PCR和Western blot检测转染后YY1的表达情况;比较miR-410-3p类似物、类似物阴性对照及类似物+YY1过表达三组间HFLS-RA细胞增殖和凋亡的变化。结果:1.RA患者滑膜组织中miR-410-3p mRNA表达水平是正常人滑膜组织的1/10(p<0.05);HFLS-RA中miR-410-3p mRNA表达水平是正常成纤维滑膜细胞(HFLS)的1/3(p<0.001)。2.转染miR-410-3p后第48小时的HFLS-RA细胞中,miR-410-3p在类似物组表达上调约1200倍(p<0.0001),在抑制剂组表达下调至1/5(p<0.0001)。3.转染miR-410-3p后第48小时的HFLS-RA细胞上清液中,miR-410-3p类似物组TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9表达明显下降(p<0.05),抑制剂组TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9表达明显上升(p<0.05)。4.转染miR-410-3p后第24、48及72小时检测HFLS-RA细胞增殖情况,miR-410-3p类似物组细胞增殖受抑制(p<0.05),抑制剂组促进细胞增殖(p<0.05);转染miR-410-3p后第48小时检测HFLS-RA细胞凋亡情况,miR-410-3p类似物组细胞凋亡受促进(p<0.05),抑制剂组细胞凋亡被抑制(p<0.05);转染miR-410-3p后第48小时检测HFLS-RA细胞周期情况,miR-410-3p类似物组细胞停滞在S期(p<0.05),抑制剂组M期细胞增多(p<0.05)。5.转染miR-410-3p后72小时检测HFLS-RA中IκBα、p-IκBα和p65、p-p65的蛋白表达,类似物组p-IκBα和p-p65蛋白表达下降(p<0.05),总IκBα和总p65蛋白水平无变化,抑制剂组p-IκBα和p-p65蛋白表达上升(p<0.05),总IκBα和总p65蛋白水平无变化;转染miR-410-3p后72小时检测HFLS-RA中NF-κB活化核移位情况,类似物组NF-κB活化受抑制,抑制剂组NF-κB活化被促进。6.BAY11-7082处理HFLS-RA72小时后,检测p65、p-p65的蛋白表达,BAY 11-7082组p-p65明显下降(p<0.0001),总p65无改变;miR-410-3p抑制剂、抑制剂阴性对照及抑制剂+BAY 11-7082三组对比,HFLS-RA上清液中TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9浓度检测,抑制剂组明显上升(p<0.05),BAY 11-7082共处理后细胞因子浓度下降(p<0.05)。7.荧光素酶报告基因检测显示miR-410-3p mimics和YY1基因的3’-UTR野生型重组报告质粒共转染后的荧光素酶活性显著降低(p<0.05),而与突变型重组报告质粒共转染后荧光素酶活性无改变,证实YY1是miR-410-3p的靶基因。8.转染YY1过表达质粒后48及72小时,分别检测其mRNA及蛋白水平表情情况,YY1组mRNA及蛋白均上升(p<0.05);miR-410-3p类似物、类似物阴性对照及类似物+YY1过表达三组对比,类似物组HFLS-RA细胞增殖受抑制、凋亡被促进,而YY1共转染组HFLS-RA细胞增殖抑制、凋亡活化的效果被回复(p<0.05),提示miR-410-3p靶向YY1调控HFLS-RA细胞增殖和凋亡。结论:1.miR-410-3p在类风湿关节炎中作为炎症抑制因子发挥作用,在RA滑膜组织及细胞中表达下调;miR-410-3p能抑制HFLS-RA细胞分泌炎性细胞因子、增殖,促进细胞凋亡,使细胞停滞在S期。2.miR-410-3p与转录因子阴阳1(YY1)存在直接作用结合。3.miR-410-3p通过抑制NF-κB信号转导通路抑制HFLS-RA细胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-6及MMP-9。4.miR-410-3p通过靶向YY1抑制其表达抑制HFLS-RA细胞增殖、促进凋亡。
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