白花蛇舌草提取液选择性杀伤肾癌细胞的机理研究

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肾细胞癌是常见的泌尿系统肿瘤,我国肾癌发病率具有逐年增加的趋势。早期肾癌的主要治疗手段是手术,预后较好。失去手术机会的进展期转移性肾癌只能依靠内科为主的综合性治疗。靶向药物治疗可以明显改善病人预后,但随着用药时间延长出现耐药现象,联合疗法对于部分病人缺乏敏感性。采用中医药治疗恶性肿瘤具有多靶点效应,全身性综合调理的优势,可以提高患者生命质量,获得相对较长的带瘤生存时间。中药药理复杂且具有一定副作用,寻找合适的中药制剂进行个体化和综合治疗,同时最大限度避免副作用,是适应现代医学临床治疗进展期肾癌的趋势。茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd,HDW)具有清热解毒、活血利尿、利湿消肿的功效,白花蛇舌草提取液具有强广谱抗肿瘤活性,可抑制多种肿瘤生长,临床常用于抗癌及抗感染治疗。本文旨在探讨白花蛇舌草干预对人肾癌细胞的增殖、周期、凋亡、抑制肿瘤迁移侵袭的影响以及可能的作用机制,来明确白花蛇舌草选择性杀伤肾癌细胞的作用,对临床进行全身性综合治疗进展期肾癌提供新的用药指导方向和理论支持。本研究通过建立人肾细胞腺癌细胞ACHN和人肾近曲小管细胞HK-2模型,利用白花蛇舌草提取液处理,应用CCK-8实验和流式实验检测其对细胞增殖、周期和凋亡的影响。应用划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,应用免疫荧光染色法观察细胞表型的变化,应用蛋白质印迹法检测细胞的上皮间充质化相关蛋白以及MAPK通路相关蛋白表达。应用RNA测序检测HDW对ACHN细胞转录组的影响。应用实时荧光定量(RT-PCR)检测ACHN和HK-2细胞中信号通路途径相关基因的表达。实验结果表明12.5%白花蛇舌草提取液这一浓度明显抑制ACHN细胞增殖活力,DNA染色发现HDW显著抑制细胞周期进展,表现为G0/G1期细胞比例降低,S期比例明显增加;周期相关基因CCNA2、CCNB1、CCNB2的表达明显受抑制;AnnexinV/PI双染检测发现HDW促进ACHN细胞早期和晚期凋亡;凋亡相关基因检测表明BIM、CASP10、PUMA表达上调,抗凋亡基因BCL-2、BCL-XL表达下调;光镜下HDW处理组ACHN细胞由处理前长梭形转变为偏圆细胞团,细胞内微丝蛋白骨架染色明显增强,表型明显变化,细胞连接趋于紧密;细胞紧密连接标志物CDH1以及相连蛋白CTNNB1细胞侧面染色明显增强;间充质表面标志物VIMENTIN和SNAIL1在HDW处理组明显降低,抑制上皮细胞间的充质化表型;划痕愈合实验和Transwell实验显示HDW显著抑制ACHN细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01),但在ACHN和HK-2细胞之间没有明显差异;通路信号相关基因及蛋白检测结果表明HDW显著下调ACHN细胞中RAP1通路相关基因表达水平和JNK蛋白磷酸化水平。以上结果提示白花蛇舌草(HDW)可以通过抑制增殖、促进ACHN细胞周期阻滞和凋亡来选择性杀伤肾癌细胞,HDW可抑制ACHN细胞中的RAP1-JNK信号通路并选择性地抑制该细胞的间质样表型,提示HDW诱导MET转化从而抑制迁移与侵袭。
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