肿瘤是威胁人类健康和生存最主要的疾病之一,恶性肿瘤发病率和死亡率日趋增高,给社会和家庭带来沉重的经济和疾病负担。肝癌(HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,全球癌症统计报告(2015)显示,全球每年约60万人被确诊为肝癌,其中中国的新发病例数及死亡病例数占了欧洲、北美总数的50%左右。当前肝癌死亡率在所有癌症中位列第二。原发性肝癌早期一般无任何临床症状,多发现和诊断于中晚期,因此预后极差。早期发现是提高肝癌五年生存率的最佳途径之一。目前肝癌的诊断方法包括血清肿瘤标志物检查(尤其是AFP表达水平)、医学影像学检查(包括B超、CT等)以及病理组织活检。作为人群健康效应评价指标的生物标志物检测,因其微创、简便、经济、易于操作而成为肝癌诊断较为理想的手段。目前临床上使用最广泛的肝癌血清标志物是AFP,但是随着AFP阴性患者的增多,肝癌患者漏检增多,直接影响肝癌患者的早期诊断和预后评价。因而发现新的肝癌血清标志物是提高肝癌检出率和生存率的当务之急。蛋白质是生命功能的直接承担者,血清蛋白标志物是最常见的标志物类型。血清成分复杂,易受机体内环境其他物质影响。血清采集后的不当保存和反复冻融等都会导致其中的蛋白质发生降解,给蛋白标志物检测带来极大困难。2007年Valadi H等的研究发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA交换遗传物质,参与细胞间通讯,外泌体由此引起研究者的重视。外泌体是一类细胞分泌的具有双层脂膜结构的囊泡,分布于外周血、尿液、唾液、腹水等体液中。携带来源细胞的病理性或生理性标志蛋白质、mRNA、miRNAs等信号分子,这些特异性的小分子可能与特异器官疾病有关。外泌体双层脂膜的存在,使得外泌体运载的物质相对少受血清中复杂成分的干扰,是标志物研究良好的材料。随后,2014年Melo SA等人发现源自乳腺癌患者细胞和血清的外泌体可以以非Dicer依赖的方式诱导非肿瘤发生上皮形成肿瘤。2015年Melo SA等发现从肿瘤外泌体筛选到的蛋白glypican-1(GPC1),或许可以作为一种潜在非侵入性诊断和筛查早期胰腺癌的工具,并且诊断灵敏度和特异度接近100%。2018年Fuhrmann G等研究者使用外泌体作为酶前体药物疗法的药物载体,研究表明外泌体作为药物靶向运载的载体有良好前景。外泌体的发现和证实将给人们对机体生理、病理过程的认识带来深刻影响,几乎所有生物医学相关的生化和分子生物学检测在外泌体分析层面上都将开启一个全新的维度。本研究提取肝癌细胞外泌体并进行质谱检测和二代测序,发现肝癌细胞外泌体差异蛋白并进行筛选和验证得到目的蛋白,同时对健康对照和肝癌患者血清中目的蛋白水平进行检测。从肝癌细胞产生的外泌体开展研究或许可以给肝癌发生发展的分子机制研究提供新的角度和思路。第一部分利用质谱和测序技术筛选肝癌细胞外泌体差异表达蛋白目的:建立肝癌细胞外泌体的提取方法,并对提取的沉淀进行验证,利用质谱和二代测序技术筛选出肝癌外泌体差异表达蛋白。方法:1.培养HL-7702、SMMC-7721、HepG2细胞,待细胞铺满培养皿底部80%左右,PBS冲洗三次,换无血清的培养基饥饿培养48 h后收集培养上清,用改良超高速离心的方法提取和纯化外泌体。2.透射电镜观察形态,Nanosight分析粒径,Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、Hsp70,进行多重验证分离的外泌体。3.利用LTQ Orbitrap Elite质谱技术检测和分析SMMC-7721、HepG2细胞外泌体蛋白组,筛选出两种肝癌细胞特异表达的蛋白。4.提取6名肝癌患者和4名健康对照的血清外泌体,构建文库并用二代测序技术进行样本检测,分析健康对照和肝癌患者血清外泌体差异mRNA。5.蛋白组学筛选特异表达的蛋白与二代测序中差异表达的mRNA取交集,筛选肝癌细胞外泌体差异表达蛋白。结果:1.采用饥饿培养和改良超高速离心的方法能有效提取外泌体,改良超高速离心法提取的外泌体背景更为干净,外泌体的双层脂膜结构清晰。2.透射电镜能观察到大小在50-90 nm之间双层脂膜结构的囊泡;Nanosight粒径分析显示颗粒大小峰值58.6 nm,平均值为96.0 nm,颗粒散点图和分布图显示颗粒直径大小较为集中,大部分介于30-120 nm的大小范围,符合预期外泌体特征;Western blot试验在HL-7702、SMMC-7721、HepG2三种细胞沉淀中均检测到外泌体的标志性蛋白Hsp70、CD9。3.质谱检出HepG2细胞外泌体总共表达2875个蛋白,SMMC-7721细胞外泌体总共表达2042个蛋白,而HepG2和SMMC-7721两种肝癌细胞外泌体共同表达蛋白845个。4.对6名健康对照和4名肝癌患者血清外泌体进行测序得到34791个转录本。根据|log2FC|>1且q-value<0.05的条件进行筛选,差异转录本有9440个。上调的差异mRNA有8963条,下调的有477条。5.蛋白组筛选特异表达的蛋白与二代测序中差异表达的mRNA取交集筛选到182个蛋白,结合二代测序中mRNA的表达差异倍数分析,log2FC大于2的上调蛋白有30个,筛选其中8个分泌蛋白作为候选蛋白进行下一步验证分析。结论:1.本研究建立了饥饿培养和改良超高速离心结合有效提取外泌体的方法。2.透射电镜观测,Nanosight粒径分析以及Western blot检测结果显示,本研究所提取的外泌体符合要求。3.蛋白组学和转录组测序筛选肝癌外泌体差异表达蛋白,结合生物信息学分析选取APOA4、ECM1、CDCP1、PXDN、AHSG、S100A13、COL7A1、FBLN1等8个分泌蛋白作为肝癌候选标志蛋白进行下一步分析。第二部分肝癌细胞外泌体差异表达蛋白验证分析目的:验证候选蛋白的表达水平,筛选目的蛋白并检测目的蛋白在血清样本间的表达水平,寻找肝癌潜在标志物。方法:1.培养HL-7702、SMMC-7721、Hep G2细胞,提取细胞Total RNA后进行反转录,利用反转录的cDNA为模板进行RT-PCR检测肝癌候选蛋白mRNA的表达水平。2.饥饿培养HL-7702、SMMC-7721、HepG2细胞48 h后收集培养上清液,改良超高速离心法分离提取和纯化外泌体,提取细胞外泌体Total RNA后进行反转录,利用反转录的cDNA为模板进行RT-PCR检测肝癌细胞外泌体的候选蛋白mRNA表达水平,筛选目的蛋白。3.培养HL-7702、SMMC-7721、HepG2、Huh-7细胞,计数后种到爬片上,细胞培养箱培养24 h后取出进行细胞免疫组化实验,检测目的蛋白COL7A1蛋白在正常肝细胞、肝癌细胞中的表达水平。4.采集30例健康对照和30例肝癌患者血清样本,性别和年龄匹配,RT-PCR检测混合血清中COL7A1 mRNA水平;采集35例健康对照和47例AFP阴性肝癌患者血清样本,性别和年龄匹配,RT-PCR检测血清中COL7A1 mRNA水平。结果:1.相对于正常肝细胞HL-7702,所有候选蛋白mRNA都在肝癌细胞中表达上调(P<0.05),而在两种肝癌细胞SMMC-7721、HepG2中均上调的蛋白有APOA4、PXDN、S100A13、COL7A1、FBLN1(P<0.05)。2.与HL-7702细胞外泌体mRNA表达水平相比,PXDN、S100A13、COL7A1、FBLN1四个候选蛋白mRNA,都在肝癌细胞的外泌体中表达上调(P<0.05),结合文献和生物信息分析,选择COL7A1作为目的蛋白进行进一步分析和验证。3.细胞免疫组化结果显示,与正常肝细胞HL-7702相比,目的蛋白COL7A1在肝癌细胞SMMC-7721、HepG2、Huh-7中表达上调(P<0.01),与肝癌细胞及肝癌细胞外泌体中表达水平一致。4.在30例健康对照和30例肝癌患者混合血清RT-PCR初筛实验中,发现肝癌AFP阴性患者COL7A1的mRNA表达水平低于健康对照;进一步在47例AFP<20μg/L肝癌病人和35例健康对照中进行验证,结果证实AFP阴性肝癌患者血清COL7A1的mRNA表达水平显著下调(P<0.001)。结论:1.COL7A1在肝癌细胞及其外泌体中表达上调,COL7A1与肝癌发生发展可能存在密切关系,其机制有待进一步研究;2.AFP阴性肝癌患者血清中COL7A1 mRNA表达水平显著下调,COL7A1 mRNA是否可能是AFP阴性肝癌的标志还有待于扩大样本多中心验证。