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研究背景与目的
在女性最常见的肿瘤中,子宫内膜癌排名第四,它在50至60岁之间的女性中更为常见,并且经常在更年期之后发生。线粒体SIRT3是一种依赖NAD+的蛋白去乙酰化酶,可维持细胞内环境的稳定。通过去乙酰化赖氨酸残基,SIRT3调节许多蛋白质的活性,以调节线粒体的生物发生、能量产生和活性氧(ROS)的稳态。近年来,越来越多的研究表明SIRT3在肿瘤生物学中起着重要作用,在某些类型的癌症中,SIRT3发挥着肿瘤促进基因的作用,因为它通过MnSOD将ROS水平调控在与细胞存活和增殖相适应的特定阈值以下。相反在一些肿瘤中,一些研究将SIRT3描述为肿瘤抑制因子,因为SIRT3可以在应激条件下触发细胞死亡。SIRT3在癌症中可能具有双重作用,但是在子宫内膜癌中,SIRT3将发挥什么样的作用不得而知,相关研究较少。因此,本研究旨在探讨SIRT3在子宫内膜癌中的对其凋亡调控机制,进一步揭示SIRT3在子宫内膜癌中的作用。
研究方法
1、利用TCGA数据库数据分析差异性表达,同时利用qPCR和WesternBlot技术检测病理标本中子宫内膜癌及其癌旁组织中SIRT3的mRNA和蛋白水平的表达;
2、Ishikawa细胞培养技术及利用CCK8实验筛选雌激素刺激Ishikawa细胞合适的浓度和时间,后利用qPCR和WesternBlot技术检测雌激素刺激后的Ishikawa细胞中SIRT3表达和溶剂组(DMSO)表达;
3、使用Lipofectamine2000将空载pEnter4质粒、pEnter4-SIRT3质粒、siRNA-SIRT3及对照转染至Ishikawa细胞,并利用qPCR和WesternBlot技术及荧光显微镜检测转染效果;
4、用转染的Ishikawa细胞模型利用流式细胞技术检测AnnexinV-FITC/PI凋亡和细胞ROS平均荧光强度、免疫荧光技术检测TUNEL凋亡染色;
5、用转染的Ishikawa细胞模型,检测细胞内SIRT3、Bax、cytoC、cleaved-Caspase3及LC3A蛋白的表达。
结果
1、TCGA数据库数据差异性分析结果显示SIRT3在EC中表达明显低于正常子宫内膜组织,高SIRT3表达的EC患者较低表达患者存活率高。mRNA水平SIRT3在EC组织中其表达明显低于其癌旁子宫内膜组织(以-action为内参,每对组织中癌旁组织作为对照计算相对表达量且癌组织组均低于1,P<0.001)。在蛋白水平SIRT3在EC组织的相对表达量明显低于癌旁组织(0.38±0.1vs0.88±0.1,P=0.001):
2、雌激素刺激Ishikawa合适的浓度和时间为0.01μmol/L和24h。在分子水平,E2刺激Ishikawa细胞会下调SIRT3mRNA的表达,与DMSO组相比,P=0.0146,在蛋白水平,E2刺激Ishikawa细胞会下调SIRT3蛋白的表达,与DMSO组相比,P=0.0219。
3、转染siRNA-SIRT3后在分子水平,与NC组相比,SIRT3mRNA的表达下调,P=0.0321,在蛋白水平,SIRT3蛋白的表达下调,P=0.0177,差异均具有统计学意义。转染pEnter4-SIRT3后在分子水平,与空载组相比,SIRT3mRNA的表达上调,P=0.008,在蛋白水平,与空载组相比,SIRT3蛋白的表达上调,P=0.024,差异均具有统计学意义;
4、AnnexinV-FITC/PI荧光染料双染检测凋亡(FITC+PI+)细胞比例分析,siRNA组对比NC组无明显差异;pEnter4-SIRT3组对比pEnter4组凋亡增加,****P<0.0001。与pEnter4组相比,pEter4-SIRT3组细胞内ROS水平下降,****P<0.0001,TUNEL免疫荧光显示SIRT3过表达凋亡增加;
5、WesternBlot结果显示,SIRT3表达上调,Bax,cytoC,cleaved-Caspase3及LC3A表达均上调,SIRT3表达下调,Bax,cytoC,cleaved-Caspase3及LC3A表达均下调,P<0.05差异均具有统计学意义。
结论
1、SIRT3的高表达很可能抑制了EC的发生发展,在EC中,SIRT3发挥抑癌基因的功能,SIRT3的低表达可能促进EC进展,这为研究EC的治疗提供了一个新的方向。
2、在Ishikawa细胞实验中,模拟雌激素刺激的环境,在细胞水平证明雌激素依赖型EC细胞中SIRT3表达降低。
3、SIRT3表达上调,凋亡增加,ROS水平降低。SIRT3或许能够通过降低ROS水平,打破EC细胞生长增殖及自我保护的平衡环境,从而将EC细胞暴露于免疫系统或者其他肿瘤杀伤因子中,促进肿瘤细胞的凋亡。凋亡刺激使线粒体释放促凋亡蛋白Bax,接着促进cytoC释放,激活caspase,cleaved-Caspase3表达增加。LC3A表达增加也许是自噬参与细胞凋亡的一部分,但是具体机制还有待深入探究。
在女性最常见的肿瘤中,子宫内膜癌排名第四,它在50至60岁之间的女性中更为常见,并且经常在更年期之后发生。线粒体SIRT3是一种依赖NAD+的蛋白去乙酰化酶,可维持细胞内环境的稳定。通过去乙酰化赖氨酸残基,SIRT3调节许多蛋白质的活性,以调节线粒体的生物发生、能量产生和活性氧(ROS)的稳态。近年来,越来越多的研究表明SIRT3在肿瘤生物学中起着重要作用,在某些类型的癌症中,SIRT3发挥着肿瘤促进基因的作用,因为它通过MnSOD将ROS水平调控在与细胞存活和增殖相适应的特定阈值以下。相反在一些肿瘤中,一些研究将SIRT3描述为肿瘤抑制因子,因为SIRT3可以在应激条件下触发细胞死亡。SIRT3在癌症中可能具有双重作用,但是在子宫内膜癌中,SIRT3将发挥什么样的作用不得而知,相关研究较少。因此,本研究旨在探讨SIRT3在子宫内膜癌中的对其凋亡调控机制,进一步揭示SIRT3在子宫内膜癌中的作用。
研究方法
1、利用TCGA数据库数据分析差异性表达,同时利用qPCR和WesternBlot技术检测病理标本中子宫内膜癌及其癌旁组织中SIRT3的mRNA和蛋白水平的表达;
2、Ishikawa细胞培养技术及利用CCK8实验筛选雌激素刺激Ishikawa细胞合适的浓度和时间,后利用qPCR和WesternBlot技术检测雌激素刺激后的Ishikawa细胞中SIRT3表达和溶剂组(DMSO)表达;
3、使用Lipofectamine2000将空载pEnter4质粒、pEnter4-SIRT3质粒、siRNA-SIRT3及对照转染至Ishikawa细胞,并利用qPCR和WesternBlot技术及荧光显微镜检测转染效果;
4、用转染的Ishikawa细胞模型利用流式细胞技术检测AnnexinV-FITC/PI凋亡和细胞ROS平均荧光强度、免疫荧光技术检测TUNEL凋亡染色;
5、用转染的Ishikawa细胞模型,检测细胞内SIRT3、Bax、cytoC、cleaved-Caspase3及LC3A蛋白的表达。
结果
1、TCGA数据库数据差异性分析结果显示SIRT3在EC中表达明显低于正常子宫内膜组织,高SIRT3表达的EC患者较低表达患者存活率高。mRNA水平SIRT3在EC组织中其表达明显低于其癌旁子宫内膜组织(以-action为内参,每对组织中癌旁组织作为对照计算相对表达量且癌组织组均低于1,P<0.001)。在蛋白水平SIRT3在EC组织的相对表达量明显低于癌旁组织(0.38±0.1vs0.88±0.1,P=0.001):
2、雌激素刺激Ishikawa合适的浓度和时间为0.01μmol/L和24h。在分子水平,E2刺激Ishikawa细胞会下调SIRT3mRNA的表达,与DMSO组相比,P=0.0146,在蛋白水平,E2刺激Ishikawa细胞会下调SIRT3蛋白的表达,与DMSO组相比,P=0.0219。
3、转染siRNA-SIRT3后在分子水平,与NC组相比,SIRT3mRNA的表达下调,P=0.0321,在蛋白水平,SIRT3蛋白的表达下调,P=0.0177,差异均具有统计学意义。转染pEnter4-SIRT3后在分子水平,与空载组相比,SIRT3mRNA的表达上调,P=0.008,在蛋白水平,与空载组相比,SIRT3蛋白的表达上调,P=0.024,差异均具有统计学意义;
4、AnnexinV-FITC/PI荧光染料双染检测凋亡(FITC+PI+)细胞比例分析,siRNA组对比NC组无明显差异;pEnter4-SIRT3组对比pEnter4组凋亡增加,****P<0.0001。与pEnter4组相比,pEter4-SIRT3组细胞内ROS水平下降,****P<0.0001,TUNEL免疫荧光显示SIRT3过表达凋亡增加;
5、WesternBlot结果显示,SIRT3表达上调,Bax,cytoC,cleaved-Caspase3及LC3A表达均上调,SIRT3表达下调,Bax,cytoC,cleaved-Caspase3及LC3A表达均下调,P<0.05差异均具有统计学意义。
结论
1、SIRT3的高表达很可能抑制了EC的发生发展,在EC中,SIRT3发挥抑癌基因的功能,SIRT3的低表达可能促进EC进展,这为研究EC的治疗提供了一个新的方向。
2、在Ishikawa细胞实验中,模拟雌激素刺激的环境,在细胞水平证明雌激素依赖型EC细胞中SIRT3表达降低。
3、SIRT3表达上调,凋亡增加,ROS水平降低。SIRT3或许能够通过降低ROS水平,打破EC细胞生长增殖及自我保护的平衡环境,从而将EC细胞暴露于免疫系统或者其他肿瘤杀伤因子中,促进肿瘤细胞的凋亡。凋亡刺激使线粒体释放促凋亡蛋白Bax,接着促进cytoC释放,激活caspase,cleaved-Caspase3表达增加。LC3A表达增加也许是自噬参与细胞凋亡的一部分,但是具体机制还有待深入探究。