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红苞凤梨叶片同时具有绿、白、红等颜色,是重要的花叶观赏植物。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt且不具编码能力的非编码RNA调控分子。本文在前期的研究基础上,以组织培养中红苞凤梨全绿和全白苗的三个阶段为材料,通过lncRNA高通量测序技术及生物信息学分析,鉴定了红苞凤梨叶片中的lncRNAs,并对其靶基因进行功能富集分析,筛选出与红苞凤梨叶片白化相关的lncRNAs,对lncABCG11和lnc88969及其靶基因克隆,构建了 CRISPR/Cas9-lncABCG11及pCAMBIA3301-lncABCG1l载体后转化红苞凤梨愈伤组织。主要的研究结果如下:1.以红苞凤梨全绿苗(绿1、绿2、绿3)和全白苗(白1、白2、白3)的三个阶段为材料,通过高通量测序技术总共鉴定了 3,543个lncRNAs和1,451个差异表达的lncRNAs。与蛋白质编码基因相比,lncRNAs整体表达水平较低、序列长度较短、外显子数目较少、开放阅读框也短于mRNAs的开放阅读框并且红苞凤梨中lncRNAs具有较低的序列保守性。2.对三个发育阶段全绿全白苗中差异表达的lncRNAs的靶基因进行GO和KEGG富集分析。GO分析表明,差异表达的lncRNA的靶基因在三个发育阶段均富集在细胞外基质部分、节律过程、免疫过程、营养物质活性和受体活性等方面。KEGG分析表明,在三个发育阶段靶基因主要富集在RNA转运、核糖体、嘌呤代谢等通路上。叶片白化相关的叶绿素代谢及光合作用的通路上也有富集。在lncRNAs与靶基因互作分析中,发现86个lncRNAs靶向36个叶绿素代谢相关的蛋白质编码基因,从中筛选出了在绿白组织中显著差异表达的25个lncRNAs及其16个差异表达的靶基因。3.克隆了lncABCG11、lnc88969及其靶基因PPO的序列,其序列长度分别为861bp、1385bp和1626bp。Blast 比对及编码能力分析表明,lncABCG11和lnc88969均无编码潜能,且都为正义lncRNA。进化树分析表明,红苞凤梨中的PPO(Protoporphyrinogen oxidase)序列与菠萝的同源性最高。4.荧光定量和测序分析发现,lncABCG11第一阶段叶片发育早期叶未展开时,在白化组织中显著上调表达,而在叶片展开,绿色明显出现后在白化组织中显著下调表达。其靶基因PORB(protochlorophyllide oxidoreductase B,PORB)的表达模式与之相同,呈现正调控关系,预测lncABCG11以顺式作用调控PORB的表达。lnc88969在第一阶段全白叶中下调,然而在叶展开后的第二、三阶段,则在白叶中上调,在第三阶段差异最显著,其靶基因PPO基因的表达模式与之基本一致,但PPO基因则在第二阶段差异最显著。5.成功构建CRISPR/Cas9-lncABCG11基因编辑载体,并转化红苞凤梨愈伤组织。共4批次浸染了 799块愈伤组织,经15mg/L HygB和20mg/L HygB各40d的筛选培养,获得绿白苗筛选抗性芽苗后转入分化培养基培养60d,抗性芽苗达到苗高3cm后转入生根培养基诱导生根,在生根培养基中生长至5cm可进行分子检测。最终获得350株抗性苗。目前检测了 180株抗性苗,但未检测到载体的特异性引物条带,暂未获得阳性转基因植株。后期需要等待剩余的抗性植株达到检测苗高后再进行检测。6.通过愈伤组织不同浓度PPT(1、2、3、4、5、6、7mg/L)的耐受性实验,发现6mg/L为愈伤组织的致死浓度,选择5～6mg/L为红苞凤梨遗传转化PPT的最佳筛选浓度。7.成功构建pCAMBIA3301-lncABCG11过表达载体,并转化红苞凤梨愈伤组织。共3批次浸染了 664块愈伤组织,经5mg/L PPT和6mg/L PPT各40d的筛选培养,获得绿白苗筛选抗性芽苗后转入分化培养基培养,目前抗性芽苗正在分化培养中培养。