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马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的第四大主粮作物。它兼具蔬菜、粮食、饲料以及工业加工原料等多种用途,在满足人民生活和经济发展方面起着至关重要的作用。然而干旱胁迫严重影响其生长发育﹑品质以及产量,是限制马铃薯生产最主要的非生物胁迫因素之一。植物对干旱胁迫的响应主要是通过调控相关基因的表达产生一系列生理﹑生化反应来实现。到目前为止,大量干旱相关基因在转录水平已被鉴定出来。但对其转录后水平调控研究的报道较少。MicroRNAs是一类重要的非编码单链小分子RNA,通常在转录后水平调节基因的表达。研究发现,其调控的靶基因参与植物的生长发育和对各种非生物胁迫的响应,并且越来越多的miRNA功能相继被鉴定出来。但这些研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物中,对马铃薯干旱相关miRNA及其靶基因的研究报道较少。本研究利用序列同源比对以及miRNA二级结构分析,在马铃薯中鉴定出3个miR159和4个miR169家族新成员以及马铃薯中可能参与调控干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的miRNAs。并且通过构建马铃薯耐旱型品种紫花白和干旱敏感型品种大西洋干旱处理和对照4个样品小RNA文库并测序,获得了大量旱相关的miRNAs。通过构建了马铃薯混合降解组文库并测序,以及降解位点进行了分析,验证了部分miRNA的靶基因,并对部分干旱相关重要靶基因的切割位点进行了5’-RLM-RACE验证。本研究获得的主要结果如下:1.基于植物miR159/169家族成员分别调控MYB和NF-YA类转录因子调控模式的保守性。本研究通过生物信息学分析在马铃薯中预测出3个miR159家族成员和4个miR169家族新成员。并通过靶基因预测,发现miR159可能调控R2R3型MYB转录因子家族成员,miR169可能调控NF-YA转录因子家族成员。并通过对miR159/169s和其预测靶基因的表达分析,发现在干旱胁迫下miR159/169s与其靶基因的表达模式呈负相关。因此,我们推断在干旱胁迫下,miR159/MYB和miR169/NF-YA的调控模式在马铃薯中也保守。2.为了研究miRNA是否参与干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控。本研究以脯氨酸代谢相关酶基因mRNA序列作为潜在的miRNA靶基因序列与miRBase中已知植物的miRNA进行比对,并获得大量候选mi RNAs,经过一系列的筛选和生物信息学分析,共获得6个miRNA家族的11个miRNAs可能与马铃薯干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控有关。结合定量PCR检测和调控机理分析,最终获得6个miRNA可能参与马铃薯干旱胁迫下脯氨酸积累代谢的调控。分别为miR172﹑miR396c﹑miR396a和miR4233可能调节脯氨酸代谢酶P5CS基因,miR2673可能调节脯氨酸代谢酶P5CR基因,miR6461可能调节脯氨酸代谢酶ProDH基因。这一研究结果可以帮助我们很好的了解干旱胁迫下miRNA参与调控脯氨酸积累代谢的分子机理。3.为了在马铃薯全基因组水平筛选干旱相关的miRNAs,本研究通过构建马铃薯耐旱型品种紫花白和干旱敏感型品种大西洋干旱处理和对照4个样品小RNA文库并进行sRNA高通量测序。通过将测序结果与miRNAbase比对以及一系列生物信息学分析。最终在4个样本中共鉴定出1,338个miRNA,其中59为马铃薯已知的miRNA,1,279个为马铃薯新预测的miRNA;并对这些miRNA进行干旱胁迫下差异表达分析,结果表明在马铃薯干旱敏感型品种大西洋中有318个miRNA在干旱处理前后差异表达,在马铃薯耐旱型品种紫花白中有89个miRNA在干旱处理前后差异表达,并通过靶基因预测获得大量差异表达mi RNA的靶基因。4.miRNA功能研究的关键是鉴定其调控的靶基因。本研究为了更好的阐述差异表达miRNA参与干旱胁迫调控的分子机理,通过构建马铃薯混合降解组文库并测序,在马铃薯中共检测到84个靶基因的90个降解位点发生降解。通过对靶基因的功能注释,最终鉴定出12个mi RNA靶基因与干旱相关,其中7个mi RNA靶基因获得了5’-RLM-RACE验证。这些靶基因包括一些干旱相关的功能蛋白(抗坏血酸过氧化物酶,谷胱甘肽S转移酶和泛素结合酶),信号传导的激酶(丝氨酸/苏氨酸激酶)和转录因子(HD-Zip类转录因子,SPL类转录因子,NAC类转录因子和锌指结构类转录因子)。荧光定量PCR表达分析表明,这些miRNA的表达量在马铃薯耐旱型品种紫花白或干旱敏感型品种大西洋干旱处理前后存在明显的差异。以上结果表明:miRNA在马铃薯干旱胁迫的响应过程中起着重要的调控作用。