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目的:Girdin是由日本学者在2005年首次发现的一种肌动蛋白结合蛋白。研究发现Girdin在促进细胞的迁移及血管生成等方面起到重要的作用。细胞迁移不仅是细胞进行重要生理活动的基础,同时也是肿瘤发生、发展等病理过程中的重要步骤和关键环节,本研究将Girdin与肿瘤运动和侵袭相关联,通过小RNA干扰技术降低Girdin在恶性胶质瘤LN229和U87细胞中的表达,深入研究其对恶性胶质瘤侵袭和凋亡能力的影响,为临床治疗恶性胶质瘤提供新的靶点。方法:第一部分:1.用小RNA干扰技术降低恶性胶质瘤细胞株LN229和U87中Girdin蛋白的表达水平,通过Western blotting技术验证其降表达效率,并筛选出稳定降表达的克隆。2.用划痕实验、趋化运动实验和趋化动力学实验检测Girdin对恶性胶质瘤细胞的运动能力的影响。3.用肌动蛋白聚合实验检测EGF刺激不同时间后Girdin降表达对细胞骨架蛋白actin聚合能力的影响。4.用粘附实验检测Girdin降表达对恶性胶质瘤细胞粘附能力的影响。5.采用Western blotting技术检测Girdin降表达粘附相关蛋白FAK和integrin β1的磷酸化水平的变化;同时用Western blotting技术检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表达水平,验证Girdin降表达对恶性胶质瘤细胞基质金属蛋白酶的表达水平的影响。6.通过裸鼠皮下成瘤实验验证Girdin的降表达对胶质瘤细胞体内侵袭能力的影响。第二部分:1.用小RNA干扰技术降低恶性胶质瘤细胞株LN229中Girdin蛋白的表达水平,同时采用瞬转的方法降低U87中Girdin的表达,通过Western blotting技术验证其降表达效率。2.应用细胞增殖实验和MTT法检测Girdin对恶性胶质瘤细胞增殖能力的影响。3.DAPI染色、流式细胞术及AnnexinV/PE凋亡试剂盒检测Girdin表达下降对细胞凋亡能力的影响。4.Western blotting技术检测Girdin表达下降后,凋亡相关蛋白分子细胞色素C(cytochromeC,Cyt-C)、Bad 的表达情况,5.将稳定降表达Girdin的细胞及对照组细胞分别接种于裸鼠皮下观察移植瘤在裸鼠体内的生长情况。6.免疫组织化学染色方法检测Girdin表达下降后Cyt-C、Bad在裸鼠移植瘤组织中的表达情况。结果:第一部分:1.胶质瘤细胞株LN229和U87经转染后,Girdin蛋白表达水平明显下降。2.与对照组相比,Girdin降表达后胶质瘤细胞的迁移能力和趋化运动能力较对照组细胞显著下降(P<0.05)。3.与对照组相比,Girdin降表达导致LN229细胞的F-actin聚合能力明显下降(P<0.05)。4.Girdin降表达后,恶性胶质瘤细胞株LN229和U87的粘附能力比对照组显著降低(P<0.05)。同时Western blotting结果显示磷酸化的integrin β1及FAK表达水平较对照组降低。5.体外细胞侵袭实验结果显示,Girdin降表达后细胞的侵袭能力较对照组细胞显著减弱(P<0.05)。同时与细胞侵袭相关的MMP-2和MMP-9的表达也明显降低。6.体内侵袭实验进一步证实,实验组裸鼠发生组织浸润的数量较对照组显著减少(P<0.05)。第二部分:1.Western blotting检测结果显示转染小RNA干扰技术有效降低LN229细胞中Girdin的表达。合成的小RNA片段转染U87细胞后Girdin的表达水平降低。2.与对照组相比,Girdin降表达后LN229细胞的增殖能力明显下降(P<0.05)。3.DAPI染色、流式细胞术及AnnexinV/PE凋亡试剂盒等检测结果发现Girdin表达下降LN229和U87细胞的凋亡能力均明显下降(P<0.05)。4.Western blotting检测显示线粒体释放的Cyt-C比对照组增加;同时实验组细胞内Bad蛋白表达水平也明显升高(P<0.05)。5.体内实验显示,Girdin表达下降后移植瘤的生长能力较对照组细胞显著减弱(P<0.05)。6.免疫组织化学染色结果显示,Girdin表达下降的移植瘤组织中Cyt-C在胞浆中的表达较对照组明显增加;与对照组相比较,siGirdin组细胞中Bad表达水平升高。结论:1.Girdin参与调控恶性胶质瘤细胞的迁移过程。其过程可能是通过调节恶性胶质瘤细胞骨架重塑来实现的。2.Girdin通过调节integrin β1及FAK的磷酸化水平从而调控恶性胶质瘤细胞的粘附能力。3.Girdin通过调节MMP-2和MMP-9的表达影响恶性胶质瘤细胞向细胞外基质侵袭的过程。4.降低Girdin的表达能够抑制恶性胶质瘤细胞的生长,促进细胞凋亡,这些作用可能是通过调节Bad和Cyt-C的表达而实现的。