Ca2±作为主要的环境限制因子之一,显著影响贝类的生长和珍珠的品质。然而,环境Ca2+如何影响贝类珍珠质沉积的分子机制目前仍不清楚。本研究以我国最主要的淡水育珠蚌——三角帆蚌(Hyprosis cumingii)为材料,以Ca2+浓度为关键调控因子,通过测定不同Ca2+浓度下珍珠质沉积量、珍珠质晶体形态、组织酶活性等指标,筛选出适宜三角帆蚌珍珠质沉积的水体Ca2+浓度,为养殖业提供基础数据；通过数字基因表达谱分析(RNA-Seq),筛选出参与珍珠质形成的主要矿化相关基因,确定Ca2+浓度影响珍珠质沉积的主要代谢和信号转导途径,从而阐明Ca2+影响三角帆蚌珍珠质沉积的分子机理,也为贝类生物矿化机制提供新的研究思路。1、采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了三角帆蚌钙代谢关键的调控因子钙调蛋白(CaM)及其类似蛋白(CaLP)基因的cDNA全长序列,序列长度分别为726bp和1217bp。组织特异性表达分析表明CaM mRNA主要在鳃、外套膜中央膜和腹足中表达,而CaLP mRNA主要在外套膜缘膜突起中表达。Ca2+迁移电泳结果表明,重组CaLP蛋白比重组CaM蛋白具有更高的Ca2+亲合力。Ca2+刺激实验结果表明,CaM和CaLP在不同Ca2+浓度下(0.25-1.25mM)具有不同的表达模式,CaM mRNA在Ca2+低浓度(0.25mM)时表达量最高,而CaLP mRNA在1.0mM Ca2+浓度时表达量最高。2、采用RACE技术克隆了三角帆蚌中重要的矿化相关基因α-碳酸苷酶(HcCA) cDNA的全长序列,长度为1911bp,编码550个氨基酸。时空表达分析表明,HcCA mRNA主要在幼蚌的外套膜中表达。空气干露、低温和低pH处理实验结果表明,mRNA的表达受到上述环境因子的影响,提示其可能在体内酸碱平衡中发挥了重要作用。3、不同Ca2+浓度下三角帆蚌养殖实验结果表明,1龄三角帆蚌在Ca2+浓度在1.0mM时生长最快,2龄未植片三角帆蚌在Ca2+浓度1.0-1.75mM时生长性状和珍珠质沉积上优于其它Ca2+浓度,2龄植片三角帆蚌在Ca2+浓度1.0mM时珍珠沉积量最大。珍珠质小片拉曼光谱和扫描电镜观察结果表明,1.5mM Ca2+浓度处理组珍珠质小片中有机质的含量高于其它处理组小片的含量。鳃和外套膜组织中碱性磷酸酶(AKP)、Ca-ATP酶、Mg-ATP酶活性测定结果表明,Ca2+浓度在1.0mM-1.75mM时有利于三角帆蚌Ca2+的吸收和蓄积。因此,1.0-1.75mM Ca2+浓度为2龄三角帆蚌生长和珍珠质沉积适宜的水体Ca2+浓度。4、采用Illumina HiSeqTM2000平台对外套膜边缘膜组织进行转录组从头测序(RNA-Seq),获得约50M高质量reads,组装成61,119个平均长度为450bp的Unigene作为参考基因组。Unigene在NR、Swiss-Pro、KEGG、COG、GO数据库中共有15,655个获得注释。其中6,322个被注释到生物学过程、分子功能和细胞组分GO类别的55个功能组,11,670个Unigene匹配到25类COG功能组,6,322个Unigene被富集到257条KEGG代谢途径。分析发现三角帆蚌贝壳基质蛋白Unigene37个,生物矿化相关基因Unigene55个,钙代谢相关基因Unigene94个。5、采用RNA-Seq技术对0.25mM、1.5mM和2.0mM Ca2+浓度处理组2龄三角帆蚌外套膜边缘膜组织进行基因差异表达分析。结果表明,在1.5mM vs0.25mM比对组中共有1604个DEGs表达上调,1489个DEGs表达下调；在1.5mMvs2.0mM比对组中共有762个DEGs表达上调,596个DEGs表达下调；筛选出2个比对组中均差异表达的基质蛋白DEGs4个(Papilin、Shematrin8、Nacre serine protease inhibitor1、Perlucin6),生物矿化相关DEGs13个(Chitin synthase、 Carbonic anhydrase、C-type lectin等),钙代谢相关DEGs5个(Calmodulin-like protein、Sarcoplasmic calcium-binding protein、Troponin C等)。KEGG代谢途径显著性富集分析结果表明,1.5mM vs0.25mM比对组中有384个DEG被富集到维生素消化和吸收、蛋白消化和吸收、吞噬体、酪氨酸代谢等24个代谢途径；1.5mM vs2.0mM比对组中有426个DEG被富集到维生素消化和吸收、吞噬体、细胞粘连、细胞骨架调节等35个代谢途径。结果提示,上述差异表达基因和代谢途径可能是Ca2+影响珍珠质沉积的主要基因和代谢途径,它们在三角帆蚌珍珠质形成过程中发挥着关键的调控作用。