背景心脏移植手术为严重终末期心脏病患者带来了福音,而减轻供心低温保存过程中的损伤是心脏移植成功的关键,尽管许多研究者对各种心脏保存液的成分及其灌注方式进行了调整,如添加血浆有效成分、氟碳化合物、氧自由基清除剂、营养基质、钙离子拮抗剂等,这些都不同程度地提高了低温保存心脏的心功能,但供体心脏保存时间大于6h时,这些改进措施的效果不理想。供心在低温保存期间细胞凋亡的发生是制约心脏保存时限的主要因素之一。若能有效地抑制心肌细胞凋亡,就有可能为器官低温保存提供新的药物作用靶点,提高供心在长时程低温保存的有效性,延长供心保存时间,使远距获取供心,扩大供心来源成为可能。连接蛋白43(connexin43,Cx 43)是心室肌细胞间的一种主要的连接蛋白。以往的研究一直认为,Cx 43仅存在于心肌细胞质膜上,在心肌细胞膜表面,6个Cx 43形成一个连接子,再由相邻细胞接触面上的连接子对接而成的缝隙连接通道,该通道主要介导相邻细胞间的电耦联和小分子化学信号分子的传递(如K+、Na+、Ca2+、cAMP、IP3等),即心肌细胞间通讯的作用。然而近年的研究发现Cx43的分布并不局限于细胞质膜上,且除了细胞间通讯外还可能存在其他新的功能。目的(1)研究Cx43蛋白过表达对冷保存H9c2心肌细胞的保护作用。(2)探讨Cx43蛋白过表达对抗冷保存诱导的心肌细胞损伤的可能机制。方法(1) pEGFP-cl-Cx43真核表达载体的构建：收集培养的H9c2细胞提取其总RNA,逆转录得到cDNA。根据大鼠Cx43基因阅读开放框(open reading frame, ORF)设计一对引物,并在引物中引入两个酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ。上游引物：5’TCCAGTCACCCATAGAATTCGAA 3’,其中下划线部分为EcoRⅠ酶切位点,下游引物：5’GTGGATCCTTAAATCTCCAGGT 3’,其中下划线部分为BamHⅠ酶切位点。以此为引物,以逆转录获得的cDNA为模版,PCR扩增Cx43全长。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析。经琼脂糖电泳鉴定的PCR产物胶回收后用EcoRⅠ和BamHⅠ分别酶切2小时,进行胶回收。胶回收产物抽干后用T4 DNA Ligase 22℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α,随后挑取克隆,酶切鉴定为阳性后,送上海生工生物有限公司测序。(2)构建点突变载体S262A-Cx 43：利用定点突变技术,设计包含一对突变位点的引物,上游引物：5’AAAGACTGCGGAGCTCCAAAATACG 3’;下游引物：5’CGTATTTTGGAGCTCCGCAGTCTTT 3’.以构建的pEGFP-cl-Cx43为模版,PCR扩增质粒全长。将PCR产物用DpnⅠ酶切,消化模板质粒。将消化后的PCR产物沉淀,转化大肠杆菌DH5α。所得的质粒即为Cx43蛋白磷酸化位点第262位丝氨酸(S)突变成丙氨酸(A)的突变体。(3) Western blotting:利用Cx43、和p-S262-Cx43抗体观察各组细胞总Cx 43蛋白的表达和S262磷酸化情况。(4)实验分组和冷保存处理：分无转染任何质粒的H9c2细胞组(空白对照组)、空载体组、稳定转染了pEGFP-cl-Cx43的H9c2细胞组(Cx43组)和稳定转染了pEGFP-cl-S262A-Cx43的H9c2细胞组(S262A-Cx43组)。各组细胞在Celsior保存液4℃保存0-48 h后,去Celsior保存液换成DMEM培养基,放入37℃、CO2孵箱中继续培养1 h。(5)细胞活力测定：取体外培养的H9c2细胞,用MTT法测定冷保存后细胞活力。(6)LDH测定：测定各组细胞冷保存后培养基中LDH含量。结果(1)酶切和测序结果表明成功构建了pEGFP-cl-Cx43真核表达载体和其262位丝氨酸突变体S262A。(2)过表达Cx43蛋白对冷保存诱导的H9c2细胞损伤的影响空白对照组细胞低温保存12-48 h再常温培养1h后,与低温保存0h的细胞相比,细胞存活率明显降低,LDH释放量增加(P<0.05)。与经过相同时间低温保存处理的空白对照组细胞相比,Cx43组细胞的存活率显著增高,LDH含量显著下降。(3)过表达Cx43的H9c2细胞对抗冷保存损伤作用与缝隙连接的形成无关MTT结果显示,不同密度接种的空载体组细胞冷保存后细胞活力均呈时间依赖性降低,而Cx43组细胞即使在低密度接种(Cx43不形成细胞间缝隙连接)的情况下,仍可显著对抗低温保存损伤。(4)S262A突变取消Cx43蛋白过表达对冷保存细胞的保护作用与经过相同时间低温保存处理的Cx43组细胞相比,S262A-Cx43组细胞的存活率明显下降,LDH释放量明显增加。结论Cx43过表达能够对抗冷保存引起的心肌细胞损伤,其机制可能与Cx43第262位丝氨酸的磷酸化有关。