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背景与目的癫痫是临床上常见的一种中枢神经系统疾病。国内外研究发现癫痫发作可使线粒体结构功能受损,呼吸链活性氧产生增加、DNA突变、钙超载、脂质过氧化及细胞色素C释放,导致细胞凋亡。因此,我们能否通过维持线粒体正常结构和功能,以寻找癫痫治疗的新靶点。Mfn2蛋白主要存在于线粒体膜中,Mfn2不仅介导了线粒体的融合和分裂,也在线粒体的运输、内质网/肌浆网与线粒体的相互作用以及细胞的代谢、凋亡和自噬等方面发挥了重要作用。Mfn2突变在退行性神经疾病中得到了广泛的研究,如腓骨肌萎缩症、阿尔茨海默病和帕金森病等。但目前为止,有关Mfn2是否参与了癫痫损伤,在癫痫的神经损害中有何作用,国内外文献还未见报道。本研究使用体外培养大鼠海马神经元,无镁诱导构建癫痫模型,慢病毒感染干预Mfn2表达,观察海马神经元的形态,检测细胞氧化应激及凋亡指标。探讨Mfn2调控的线粒体功能是否在癫痫的神经损伤中发挥保护作用。方法取出生24h内的Sprague-Dawley大鼠,断头处死后迅速取出大脑,剥离双侧海马,制成单细胞悬液,于体外进行原代神经元培养。在第7天进行神经元纯度鉴定,无镁环境下构建癫痫放电模型。在培养第10天使用QPCR及Westren blot检测对照组、无镁处理3h组、6h组、12h组、24h组、48h组细胞内Mfn2的表达。使用慢病毒转染Mfn2,培养至第10天无镁诱导6h后分为五组:对照组(CON)、无镁致痫组(AE)、无镁致痫+空载体组(AE+LV)、无镁致痫+干扰Mfn2组(AE+LV-Mfn2-sh RNA)及无镁致痫+过表达Mfn2组(AE+LV-Mfn2)。比较五组海马神经元的形态,NES染色鉴定海马神经元纯度,比色法检测SOD测定氧化损伤,蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2、Cyt-C测定细胞凋亡。结果细胞形态学培养7天时倒置显微镜下观察海马神经元胞体丰满,部分细胞核空泡化,胞体周围光晕明显,已具备典型的轴突、树突,细胞间形成紧密网络。神经元纯度测定培养7天后海马神经元进行NSE染色后,在荧光显微镜下观察计数得神经元纯度为90%以上。不同致痫时间的Mfn2表达情况与CON组相比,致痫3h组、6h组Mfn2m RNA及Mfn2蛋白表达降低,差异有统计学意义,P<0.05。转染慢病毒后Mfn2表达情况与CON组相比,AE组、AE+LV组、AE+LV-Mfn2-sh RNA组细胞内Mfn2 m RNA及Mfn2蛋白表达降低,AE+LV-Mfn2组细胞内Mfn2 m RNA升高,差异均有统计学意义,P<0.05;与AE组比较,AE+LV-Mfn2-sh RNA组细胞内的Mfn2 m RNA及Mfn2蛋白表达下降,AE+LV-Mfn2组细胞内Mfn2 m RNA表达升高,差异具有统计学意义,P<0.05。SOD蛋白表达情况与CON组相比,AE组、AE+LV组、AE+LV-Mfn2-sh RNA组SOD表达下降,差异具有统计学意义,P<0.05。与AE组相比,AE+LV-Mfn2-sh RNA组SOD表达下降,AE+LV-Mfn2组SOD表达升高差异具有统计学意义,P<0.05。Bcl-2、Bax、Cyt-C蛋白表达情况与CON组比较,AE组、AE+LV组、AE+LV-Mfn2-sh RNA组Bcl-2、Bcl-2/Bax、线粒体Cyt-C表达下降,Bax、胞质Cyt-C表达升高,差异具有统计学意义,P<0.05。与AE组比较,AE+LV-Mfn2-sh RNA组Bcl-2、Bcl-2/Bax、线粒体Cyt-C表达下降,Bax、胞质Cyt-C表达升高,AE+LV-Mfn2组Bcl-2、Bcl-2/Bax、线粒体Cyt-C表达下降,Bax、胞质Cyt-C表达升高,差异具有统计学意义,P<0.05。结论1.无镁致痫的大鼠海马神经元,Mfn2表达一过性下降,SOD下降,Bcl-2/Bax降低及Cyt-C从线粒体转移到细胞质。提示Mfn2调控的线粒体功能参与了癫痫的病理过程,癫痫可以导致细胞氧化应激及细胞凋亡。2.转染慢病毒上调Mfn2表达,无镁诱导后细胞SOD下降,Bcl-2/Bax下降和线粒体释放Cyt-C均被抑制;下调Mfn2表达无镁诱导后细胞SOD下降,Bcl-2/Bax下降和线粒体释放Cyt-C进一步加重。提示Mfn2通过减少线粒体氧化应激,抑制凋亡途径,保护了海马神经元。3.调控线粒体功能在癫痫治疗中具有潜在研究价值。