乳酸菌是人和动物肠道中的重要生理菌群之一，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能。一些乳酸菌属还能代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素等物质，而这些物质能够抑制病原菌和腐败菌，是微生态制剂具有特殊保健功能的原因之一。除具有益生菌功能外，乳酸菌还可作为宿主菌表达抗原或外源蛋白，作为疫苗载体刺激粘膜免疫应答或作为功能性或治疗性蛋白的传递载体。但目前，乳酸菌口服后在胃肠道中的活动状况，其作为疫苗载体刺激免疫应答的免疫机制等问题还不清楚。要弄清楚乳酸菌进入体内后的状态，最好的方法就是对其进行标记然后跟踪观察。此外，无论是作为益生菌或是疫苗载体，乳酸菌到达肠道后均需要维持一定的活菌数才能发挥其作用，而口服需要经过胃酸环境，将对其存活率有极大影响，因此如何提高乳酸菌经胃酸环境后到达肠道的存活率是目前研究的一个热点。 鉴于此，以乳酸菌中的典型菌属——乳酸乳球菌为代表，制备其海藻酸钙微囊，希望为其提供物理防护以抵抗胃肠道的恶劣环境。同时，我们在乳酸乳球菌细胞内表达GFP，并以GFP表达为活菌标记，检测乳酸乳球菌经口服后到达肠道的存活率，从而确定海藻酸钙微囊包裹对乳酸乳球菌在胃肠道环境，特别是胃酸环境中的保护作用。 本文以乳酸乳球菌的NICE表达系统为基础，选取该系统中的pNZ8150质粒为表达载体，将gfp基因插入其特定位置，构建GFP的重组表达载体。然后将该重组表达载体电转化至宿主菌NZ9700和NZ9000中，构建GFP的组成型表达系统和诱导型表达系统。通过荧光显微镜观察以及荧光分光光度计测量荧光值，表明两种系统均成功表达GFP。其中，组成型表达菌株的GFP表达量较大，约为诱导型表达菌株的8倍，而且传代10次后仍能稳定表达。 根据上述结果，选取稳定表达GFP且表达量较大的组成型表达菌株（NZ9700:pNZ8150-gfp）作为囊心物，制备其海藻酸钙微囊制剂。并通过体外耐酸实验筛选最优化微囊制备处方。将根据该优化制备处方制备的NZ9700:pNZ8150-gfp海藻酸钙微囊以及未包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp分别置于pH2.0酸性环境中进行体外耐酸实验，一定时间后分别测量并比较两者的存活率，从而确定该海藻酸钙微囊对乳酸乳球菌在酸性环境中的保护作用。结果表明，酸处理30min，60min，90min，120min后，该海藻酸钙微囊包裹分别使乳酸乳球菌的存活率提高了1370倍，525倍，235倍和105倍，说明其对乳酸乳球菌在酸性环境中有显著的保护作用。 显微镜下观察，根据该处方所制备的微囊样品呈较规则球状。采用粒径粒形分析仪测样品粒径，结果显示，所制备微囊样品粒径范围为3~80μm，平均粒径为22.91μm。 然后将上述海藻酸钙微囊包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃至小鼠体内，以所表达的GFP为活菌标记，确定到达小肠内的活菌数，同时与未经包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃小鼠组，以及空白小鼠组进行比较，确定海藻酸钙微囊包裹对乳酸乳球菌在胃肠道环境中的保护作用。结果表明，以109CFU的活菌数灌胃，则灌胃2h后，Microencapsulated Lactococcus lactis组小鼠小肠内的活菌数约为3.2×108CFU，而Free Lactococcus lactis组小鼠小肠内的活菌数约为3.4×106CFU，前者存活率约为后者的98倍，证明了海藻酸钙包裹对乳酸乳球菌在胃肠道环境，特别是胃酸环境中确实有一定的保护作用。 通过以上研究，确定了对乳酸乳球菌在体外酸性环境中具有显著的保护作用的海藻酸钙微囊制备处方。根据该处方制备的海藻酸钙微囊可提高乳酸乳球菌在胃肠道环境中的存活率，从而增加到达肠道的抗原或治疗性蛋白的量，为增强给药有效性提供一定帮助。此外，通过以NICE系统为基础构建标记基因gfp的稳定表达系统，也为跟踪观察乳酸菌进入体内后的活动状况以及研究乳酸菌作为口服疫苗载体刺激粘膜免疫应答的机制，提供了一个较好的研究模型。