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胸腺苷酸合成酶(Thymidylate synthase,简称TS)催化dUMP生成dTMP和二氢叶酸,dTMP再进一步转化为dTTP,后者是DNA合成的重要前体。多年来TS一直作为癌症化疗的一个重要靶点,斑马鱼作为一种重要的模式生物,已成功用于多种药物筛选模型的构建,但斑马鱼Ts的序列分析、表达调控规律以及在发育过程中的功能尚未见报道。本研究的主要目的是分析TS在斑马鱼体内的表达调控机制,阐明TS在斑马鱼发育过程中的作用,为构建斑马鱼药物筛选模型提供理论基础。 采用RT-PCR和RACE技术,从斑马鱼胚胎中克隆出TS的cDNA全长序列,分析表明它的编码框序列含有957个核苷酸,编码一个分子量为36kD的318个氨基酸的蛋白序列。将斑马鱼TS蛋白完整编码序列连接到pET-28a表达载体上,构建表达载体pET-28/Z-TS,转化进大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导性融合表达,实验表明在1mM的IPTG浓度条件下,诱导表达3h,斑马鱼TS融合蛋白表达量达到比较高的水平。而几种不同浓度的IPTG诱导对融合蛋白的表达量影响较小。利用亲和层析技术分离纯化,获得均一性TS蛋白。酶学性质研究表明纯化的斑马鱼TS蛋白在较低的温度仍呈现酶的催化活性,28℃催化活性达到高峰。测定它与dUMP和二甲基四氢叶酸的相互作用的Km值,结果表明它与人的TS蛋白的Km值接近。 Western杂交分析表明纯化的斑马鱼TS蛋白能够被人的TS单克隆TS-106抗体识别,亲和性与人的TS纯化蛋白表现一致。通过Western杂交分析方法检测斑马鱼TS蛋白在斑马鱼不同胚胎发育时期的表达规律,结果表明TS蛋白在胚胎各个时期都有表达,在1-,4-细胞期表达量较高,说明TS对维持斑马鱼胚胎的发育过程具有重要意义。 为了阐明TS在斑马鱼胚胎发育过程中的重要作用,我们构建了亦斑马鱼TSmRNA为靶点的小分子发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,pSilencer4.1-CMV/TS,采用显微注射技术研究shRNA对TS基因沉默后斑马鱼发育的影响。结果表明在斑马鱼胚胎处于1-细胞期至2-细胞期注射pSilencer 4.1-CMV/TS质粒,在25hpf可引起斑马鱼胚胎发育表型改变,表现为头部和尾部都发育迟缓。为了阐明斑马鱼发育中是否存在胸腺嘧啶代谢的旁路途径,在斑马鱼胚胎培养液