阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年期痴呆的最常见的类型，其临床特点包括记忆力障碍、认知功能损害及行为异常。AD的发病率随着年龄的增加而上升。AD给家庭和社会带来沉重的负担，已经成为一个严重的社会和医疗问题。但是到目前为止，AD的发病机制尚不完全清楚，临床缺乏理想的治疗药物。因此，研究AD的发病机制及研发有效的防治药物显得尤为重要。 AD病理上以大脑出现细胞外老年斑(senile plaques，SP)、细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTS)和神经元及突触减少为特征，特定区域神经元的丧失不仅是脑萎缩的形态学基础，还是引起患者临床学习和记忆障碍的关键。越来越多的证据显示，AD发病过程中周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dendent kinases，Cdl(s)的异常激活可以导致细胞周期紊乱，诱发神经细胞死亡。 Cdks抑制剂最早用于癌症的治疗，最近已经有利用Cdks抑制剂作为神经保护剂的研究报道，但是大部分资料来自体外细胞培养实验，仅有少数研究来自神经变性和凋亡动物模型。虽然Cdks抑制剂治疗AD的可能机制尚不完全清楚，但是cdks抑制剂已经用于研究异常的Cdks活性与神经变性性疾病的关系。Cdks抑制剂极可能成为治疗AD的重要靶标。 靛玉红(indimbin)是中国医学家们在传统中成药当归芦荟丸中发现抗肿瘤有效成分。目前已经清楚靛玉红是一种选择性的IgNCdks抑制剂，它可以在纳摩尔水平抑制Cdk1、Cdk2、Cdk5的活性，但其水溶性和脂溶性都很差，且有一定的肝毒性。然而，靛玉红的衍生物：3，单肟靛玉红(Indimbin-3’-monoxime，IMX)，不仅是强有力的Cdks抑制剂，而且毒性低、分子量小、有较好的膜通透性，IMx可以与ATP竞争Cdks激酶的催化位点。本文工作旨在研究Cdks在Aβ<,1-40>诱导的AD动物模型中表达情况，并在此基础上研究Cdks抑制剂IMx对AD动物模型的实验性治疗作用。本实验不仅为AD的治疗探索新的途径和寻找有效的新药物，也为把IMx研发成临床新药积累实验基础。本文包括以下三部分工作： 第一部分 Cdk4和cyclin B1在AD动物模型中的表达分析 目的：研究周期素依赖性蛋白激酶和周期素在Ap<,1-40>诱导的AD动物模型中的表达及其与神经元凋亡的关系。 方法：应用Ap<,1-40>侧脑室内持续给药建立AD大鼠模型；应用免疫组织化学检测周期素依赖性蛋白激酶CdK4和周期素cyclin B1的表达；应用TUNEL方法检测神经元的凋亡；应用荧光双标的方法确定cdk4表达的细胞类型，同时还进行了Cdk4}Lcyclin B1与TUNEL的荧光双标实验。 结果：(1)Cdk4和cyclin B1于造模后7天就达较高水平，21天达高峰，直到28天仍然持续表达；(2)AD动物模型组TUNEL阳性细胞于造模后14天开始出现，21天达高峰并且少量持续存在；(3)存在cdk4与神经元标志性抗体的双标阳性细胞；(4)发现Cdk4和cyclin B1与TUNEL的双标阳性细胞。 结论：Cdks参与了Ap毒性引起的神经元凋亡机制，Cdks抑制剂可能减少神经元凋亡的发生。 第二部分 Cdks抑制剂3’单肟靛玉红的药物代谢动力学研究 目的：本实验研究IMx在体内的药物代谢动力学过程及其能否进入脑内，为其临床应用提供了理论依据。 方法：利用高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠血液中IMX的含量；分别研究静脉注射、腹腔注射两种给药途径后，IMX在大鼠体内的药物代谢动力学特点，应用3P87药物代谢动力学程序，计算出主要的药物代谢动力学参数；并进一步观察了静脉给药后药物在动物体内主要器官心、肺、肾、脑组织中IMX的含量。 结果：(1)鼠尾静脉注射IMX，药物代谢动力学符合二室模型。IMX在鼠体内吸收快，分布也快，药物起效快，在体内主要以消除过程为主，药物在体内滞留时间较长；(2)腹腔注射IMX后，在150min血药浓度达峰值。静脉注射10 mg/kg IMX，于不同时间处死，用HPLC测定各组织中IMX的含量，结果发现：I-ND(在心脏组织中含量较高，在1h达峰值；脑组织、肺组织中IMx含量在O.5h即达峰值；肾脏组织中IMx含量在3h达峰值，结合其化学结构特征推测，IMX易于透过血脑脊液屏障，以被动扩散为主，IMX主要分布在体循环和血流丰富的脏器中。 结论：应用HPLC法测定大鼠血浆中IMx的浓度，操作简便、省时、精密度及重现性均较好。静脉注射IMX，药物代谢动力学符合二室模型，IMx在鼠血中主要以消除过程为主，IMX主要分布在血流丰富的组织中，分布速率较快。IMX易于透过血脑脊液屏障，以被动扩散为主。 第三部分 IMx对AD动物模型行为学的影响及其神经保护机制研究 目的：研究IMX对AD大鼠神经元凋亡和学习记忆功能的影响及可能的神经保护机制。 方法：应用Ap<,1-40>侧脑室给药建立AD大鼠模型。成年健康雄性SD大鼠40只，随机分成：假手术组、AD模型组、IMX干预组Ⅰ(7.5mg/Kg i．p．)、IMX干预组Ⅱ(15mg/g i．p．)。IMX干预组在造模前1天经腹腔给药。造模后第7、14、21天行Morris水迷宫实验观测大鼠的学习和记忆功能的改变；行为学测试结束后应用组织切片原位末端标记(TUNEL)技术对额颞叶皮层和海马CA1区神经元的凋亡进行分析；应用Western blotting技术检测Cdk4和周期素cyclin B1的表达；同时还观察IMX对Cdc2激酶和ChAT活性的影响。 结果：(1)Morris水迷宫实验显示IMX治疗组Ⅰ和IMX治疗组Ⅱ大鼠的平均逃避潜伏期分别为58.7±6.34s和48.8 ±7.83s较AD模型组(66.9±6.52s)明显缩短，t=2.85(IMX治疗组Ⅰ，P