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近年来，手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)在我国呈高发态势，肠道病毒71型（enterovirus71, EV71）是其主要病原体之一，尤其重症HFMD患者大多由EV71感染所致[1]。深入研究EV71的毒力和致病机理，对于HFMD的防治有着极其重要意义[2，3]。我们从HFMD重症患者咽拭子标本中分离EV71毒株，通过基因序列分析、病毒拯救等研究，分析比较分离病毒的毒力和免疫原性，为今后EV71动物模型的构建、EV71致病机理和疫苗的研究打下了基础。本研究从2名临床确诊HFMD并出现严重神经系统症状患儿的咽拭子标本中分离到2株病毒，经核酸分析和美国ATCC肠道病毒标准血清中和实验，确定为EV71。通过空斑实验，克隆得到两株EV71病毒，分别命名为EV71-961和EV71-102。经肠道病毒VP1区通用引物扩增后，序列分析初步确定两株分离病毒均为EV71C4亚型。病毒全基因序列分析显示：两株病毒基因组全长（不含polyA尾）均为7407nt；EV71-961全基因序列与Chongqing3-09-China（Genbank Number: GQ994991.1，Cq3）同源性为97.72%（7233/7402），EV71-102全基因序列与Henan1-09-China（GenbankNumber: GU196833.1，Hn1）同源性为99.75%（7188/7206）。进一步比对分析发现，EV71-961病毒1-3760nt与Cq3同源性为99.87%（3756/3761），有5个差异位点，分别是： C9G、-90C、C716T、T2564A、T3072A；3761-7407nt与Hn1株同源性为99.97%（3556/3557）。EV71-102病毒5’NTR序列与Guangdong2009（GenbankNumber: JF799986.1，Gd2009）同源性最高，为98.65%（730/740），其余序列与Hn1同源性最高，为99.93%（6662/6667），仅5个差异位点，其中2个点为无意义突变。确定两株病毒分别为Hn1与Cq3和Gd2009株的重组病毒。文献报道Hn1为强毒株，Cq3为弱毒株[4]。为进一步探讨病毒基因重组与毒力的关系，我们利用反向遗传学技术分别构建了EV71-961、EV71-102感染性克隆进行进一步研究。将构建的感染性克隆转染Vero细胞，获得EV71-961与EV71-102的拯救病毒，病毒感染细胞敏感性试验结果为：Vero细胞＞SN‐SK（神经元细胞）＞RD＞Hela；病毒滴度（TCID50）测定结果为：拯救病毒与母本病毒滴度相似均约为7.0lgTCID50/ml；病毒一步生长曲线测定结果显示：两种病毒均在48h内致细胞病变，随后病毒的复制成几何倍数增长，与细胞病变结果一致。细胞凋亡实验结果为，病毒接种细胞后96h开始出现凋亡，168h细胞大部分凋亡。免疫荧光检测该病毒位于胞浆，可呈包涵体颗粒样聚集，拯救病毒与母本病毒结果一致。毒力与免疫原性实验结果表明：①原始病毒对乳鼠的致死率高于拯救病毒，原因可能是拯救病毒为单一克隆，而母本病毒株虽经多次纯化，但仍可能存在不同的EV71病毒多态性。②EV71-102致死率高于EV71-961，推断病毒基因重组会导致病毒毒力的改变，重组发生越多毒力改变越多。③病毒免疫小鼠后诱发机体产生很强的体液免疫反应。中和实验显示，拯救病毒与母本病毒免疫血清均能很好的中和大部分EV71分离株，病毒越纯免疫小鼠获得的免疫血清病毒中和效价越高。本研究构建的感染性克隆及获得的拯救病毒为下一步EV71动物模型、致病机理和疫苗研究打下了基础。