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背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种常见的恶性程度高,早期即可发生肺部转移并且死亡率较高的骨科恶性肿瘤,好发于儿童和青少年年龄段[1-2]。目前国内外主流的治疗方案仍然以早期外科手术扩大范围清除原发病灶,以及术后积极采用联合多种化疗药物等为主,但始终无法彻底根除骨肉瘤细胞,术后复发或发生转移的患者仍屡见不鲜,导致当前骨肉瘤治疗的研究也陷入艰难困境。随着当今科学技术的突飞猛进,使得跨学科交叉合作式研究逐渐成为一种全新的模式,而且国内外研究人员也已经尝试了物理学手段结合生物学效应的新模式来研究对恶性肿瘤的作用。极低频电磁场(Extremely low frequency electromagnetic field,ELF-EMF)对恶性肿瘤的作用研究就是近年来这其中涌现出的一个跨学科研究的新模式,并且已经取得了一些研究成果。目前研究证实了,特定参数的极低频电磁场对恶性肿瘤细胞的增殖有抑制作用或者可以诱导其细胞凋亡[3-8]。此外,美国食品和药品管理局(FDA)早在1979年就正式核准了极低频电磁场可以应用于临床疾病的治疗和康复,这也充分肯定了适当的ELF-EMF对人体是安全可靠的。近年来,肿瘤干细胞理论研究的热潮也为破解恶性骨肿瘤治疗的困局带来了新的思路和努力方向。该理论认为肿瘤组织的生长和增殖主要依赖于数量很少的肿瘤干细胞,而其他大部分细胞没有或者只有有限的增殖能力,只有这部分肿瘤干细胞可以无限增殖。只要能够有效地抑制或者杀死这部分肿瘤干细胞就可以给肿瘤的治疗和研究带来重大突破。经研究表明,多种类型的肿瘤侧群细胞(sp细胞)均具有干细胞的特性[9-10]。所以,本研究选用骨肉瘤细胞系hos细胞为体外实验细胞,首先将通过检测对照组及经elf-emf辐照组细胞的增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等,来筛选不同电磁场强度及电磁场频率的elf-emf对体外骨肉瘤hos细胞的生物学效应强弱,经过综合评估后优化出对hos细胞生物效应最强的一组elf-emf参数。然后,采用优化参数的elf-emf对hos细胞进行辐照,观察与对照组的sp细胞比率变化,再利用流式细胞仪无菌分选出骨肉瘤hos细胞的sp细胞继续常规培养,用优化参数的elf-emf辐照sp细胞及改变干预条件,通过蛋白免疫印迹实验(westernblot,wb)检测目标蛋白的表达情况,进而研究可能的信号通路作用机制。我们希望通过这一系列的实验研究,为最终能够将elf-emf应用到临床治疗骨肉瘤提供实验依据和可能的作用机制参考。实验一极低频电磁场对骨肉瘤hos细胞的体外生物效应及电磁场参数的优化筛选目的:通过检测elf-emf辐照组及对照组骨肉瘤hos细胞的细胞增殖、细胞凋亡、细胞克隆形成能力、细胞侵袭能力等,来筛选不同强度及频率的elf-emf对骨肉瘤hos细胞的体外生物效应强弱,经过统计学分析后优化出对骨肉瘤hos细胞有较强生物效应的elf-emf参数。方法:常规培养骨肉瘤hos细胞,按照固定电磁场强度为0.1mt、1mt、5mt、10mt、15mt,再分别选择不同电磁场频率为1hz、5hz、10hz、15hz、20hz、30hz、40hz、50hz进行分组辐照,一天2小时,连续辐照5天,并设立对照组。然后利用cck-8法检测骨肉瘤hos细胞的增殖变化情况,并根据od值计算各组的抑制率。经统计学分析后,筛选出对hos细胞抑制作用较强的2组elf-emf参数,再采用细胞凋亡、克隆形成能力及侵袭能力等实验检测进行验证。结果:经统计学分析各组OD值,我们得出(1 Hz,0.1 m T)组细胞增殖抑制率最强,(40 Hz,10 m T)组次之(P<0.05)。流式细胞仪检测结果表明,(40 Hz,10 m T)组骨肉瘤HOS细胞凋亡比率高于其他两组(P<0.05)。克隆形成能力实验显示,对照组细胞克隆率最大,(1 Hz,0.1 m T)实验组细胞克隆率次之,而(40 Hz,10 m T)实验组最小(P<0.05)。侵袭能力实验结果提示,(40 Hz,10 m T)组穿过Transwell小室的HOS细胞数量显著低于其他两组(P<0.05)。结论:(40Hz,10 m T)实验组ELF-EMF参数对HOS细胞有更显著的抑制增殖作用,促进其细胞凋亡,也可减弱其细胞的克隆能力,并降低其侵袭能力。实验二极低频电磁场对骨肉瘤HOS细胞作用机制研究目的:通过利用优化参数的ELF-EMF对骨肉瘤HOS细胞进行辐照,观察实验组与对照组的SP细胞比率改变情况,并利用向培养基中加入顺铂(CDDP)上调VEGF/Flt1自分泌信号,利用蛋白免疫印迹实验检测目标蛋白的表达情况,开展可能的信号通路作用机制的研究。方法:常规培养HOS细胞,利用流式细胞仪分别鉴定经优化参数的ELF-EMF辐照组和对照组SP细胞比率。应用流式细胞仪筛选出骨肉瘤HOS细胞的SP细胞常规培养,分成经优化参数的ELF-EMF辐照实验组,CDDP共培养实验组,CDDP共培养加ELF-EMF辐照实验组,并设立对照组,采用蛋白印迹实验检测目标蛋白表达的差异情况。结果:通过流式细胞仪双染分析,经优化参数的ELF-EMF辐照组SP细胞比率较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹实验结果显示,经ELF-EMF辐照实验组VEGF/Flt1蛋白表达水平相较于对照组明显下降,并且明显抑制了SP细胞的phospho-ERK1,2的磷酸化过程,但对ERK1,2的表达无明显影响。结论:优化参数的ELF-EMF可能是通过下调骨肉瘤HOS细胞的侧群细胞VEGF/Flt1蛋白表达以及抑制侧群细胞的phospho-ERK1,2磷酸化过程,从而最终抑制了骨肉瘤HOS细胞的增殖。