论文部分内容阅读
背景和目的:牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的慢性感染性疾病,伴有牙周组织破坏如附着丧失和牙槽骨吸收,严重者可发生牙松动脱落。牙周炎的治疗目前主要停滞在控制病变进一步发展,牙周组织再生是亟待解决的重要课题。牙周骨组织再生的难点在于其持续的相对开放的炎症微环境,这决定了牙周骨组织的再生要难于颌骨再生、种植体的骨增量等相对封闭环境下的骨再生。因此,研发具有抗炎和促进成骨双重作用的新技术和策略对于牙周炎相关的骨再生至关重要。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)已广泛应用于组织再生研究,但炎症微环境下干细胞生物学功能受到影响,成骨分化能力下降,难以获得有效骨质再生。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)是牙周炎的主要致病菌,其细胞壁组分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是诱导牙槽骨组织破坏、促进牙周炎发展和进展重要毒力因子。LPS可以直接抑制牙周组织干细胞的分化并增加牙周组织的吸收,另一方面还可以诱导多种细胞分泌白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子 α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子,发挥毒性作用,影响基质的形成、诱导细胞凋亡,进一步增加牙周组织破坏。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种感觉神经末梢分泌的由37个氨基酸组成的神经多肽,可通过多种途径参与骨组织的形成和修复,此外还有研究表明CGRP可以抑制炎症反应。本课题组前期研究表明高表达CGRP基因显著增强了大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)在正常体外培养条件下的成骨分化能力,在此基础上,本课题使用P.g LPS构建炎性环境研究高表达CGRP基因对炎症环境下rBMSCs的增殖、免疫反应及成骨分化的影响,并建立LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型进一步研究高表达CGRP基因的rBMSCs对缺损区炎症浸润与骨修复的作用,旨在减少或排除牙周组织修复及再生过程中炎症微环境的干扰,促进牙周组织再生。为了充分验证CGRP在成骨与破骨分化中的作用,本课题进一步构建高表达CGRP基因的小鼠单核巨噬细胞系264.7(RAW264.7),研究CGRP对体外培养的RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响,探讨如何减少牙周炎导致的牙槽骨吸收,促进牙周组织再生,并使再生的牙周组织在结构及功能上恢复到生理状态,为临床治疗中实现牙周组织完全再生提供重要的理论基础。方法:1.rBMSCs的分离培养及鉴定全骨髓贴壁法分离培养Wistar大鼠股骨及胫骨rBMSCs,Flow cytometer检测表面标志抗原,成脂向及成骨向诱导后Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs的多向分化潜能。2.高表达CGRP的rBMSCs、RAW264.7的构建1)慢病毒转染rBMSCs,分为c-rBMSCs组(高表达CGRP的rBMSCs)、empty vector组(转染空载体病毒的rBMSCs)、rBMSCs组(正常rBMSCs),检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。2)慢病毒转染RAW264.7,分为c-raw(高表达CGRP的RAW264.7)、empty vector组(转染空载体病毒的RAW264.7)、raw组(正常RAW264.7),检测CGRP mRNA和蛋白的表达水平。3.高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs增殖、免疫调节及成骨分化的影响1)CCK-8法检测高表达CGRP对rBMSCs炎症环境下增殖的影响。2)Realtime PCR检测高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs IL-1β和TNF-α表达水平的影响。3)ELISA试剂盒检测高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs IL-1β和TNF-α分泌水平的影响。4)RealtimePCR、Western Blot检测碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)、核心结合因子-2(runt-related transcription factor-2,RUNX2)mRNA和蛋白的表达水平;通过Alizarin Red染色测定rBMSCs的成骨分化能力。5)建立LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型,分为Control组(只在缺损区植入胶原膜)、rBMSCs组(在缺损区植入负载rBMSCs的胶原膜)、c-rBMSCs组(在缺损区植入负载高表达CGRP的rBMSCs的胶原膜),HE染色及Micro-CT分析高表达CGRP对rBMSCs在LPS处理的大鼠牙周骨缺损区修复作用的影响。4.高表达CGRP对RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响1)Realtime PCR检测高表达CGRP对炎症环境下RAW264.7 IL-1β和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA 表达水平的影响;Western Blot检测高表达CGRP对LPS刺激的RAW264.7 NF-κB通路活化的影响。2)Realtime PCR、Western Blot 检测高表达 CGRP 对 RAW264.7 破骨诱导条件下组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、c-FOS、活化T细胞核因子1(Nuclear Factor of Activated T Cells 1,NFATc-1)mRNA 及蛋白表达水平的影响。结果:1.rBMSCs的分离培养及鉴定全骨髓贴壁法分离培养Wistar大鼠股骨及胫骨rBMSCs,细胞大部分呈梭形,放射状排列。Flow cytometer检测rBMSCs的表面标志物CD29、CD44、CD90、CD45、CD1 1b 的表达阳性率分别为 98.9%、98.4%、98.8%、0.20%、0.41%,符合间充质干细胞表面标志物表达的特性。Oil red O、Alizarin Red染色检测rBMSCs成脂及成骨向分化潜能,染色结果均为阳性。2.高表达CGRP基因的rBMSCs和RAW264.7的构建病毒液分别转染rBMSCs、RAW264.7,转染CGRP慢病毒的细胞CGRP mRNA及蛋白的表达水平明显高于相应empty vector组和对照组(P<0.05),而empty vector组和对照组表达较弱且无统计学差异(P>0.05)。3.高表达CGRP对炎症环境下rBMSCs增殖、免疫调节及成骨作用的影响1)1μg/ml LPS炎症环境下,CCK-8结果显示c-rBMSCs增殖速度大于rBMSCs(P<0.05)。2)加入1μg/ml LPS,24h后提取各组细胞RNA,Realtime PCR检测结果显示,c-rBMSCs 炎症因子 IL-1β、TNF-αmRNA 表达水平低于 rBMSCs(P<0.05);ELISA检测结果显示c-rBMSCs炎症因子IL-1β、TNF-α分泌水平低于rBMSCs(P<0.05)。3)检测各组细胞在1μg/ml LPS的炎症环境下矿化诱导2w、3w后ALP、BSP、RUNX2 mRNA和蛋白的表达水平,结果显示:c-rBMSCs较rBMSCs ALP、BSP和RUNX2mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);矿化诱导3w后Alizarin Red染色c-rBMSCs形成的矿化结节明显多于rBMSCs(P<0.05)。4)高表达CGRP对rBMSCs在LPS处理的大鼠牙周骨缺损区修复作用的影响。HE染色结果示:c-rBMSCs组较Control组、rBMSCs组缺损区炎症浸润明显减轻,且缺损区可见大量新生骨,几乎完全充填了缺损区。Micro-CT结果示:rBMSCs组骨缺损区骨密度高于Control组(P<0.05),c-rBMSCs组缺损区骨密度明显高于Control组与rBMSCs组(P<0.05),且缺损区基本被新骨完全填满。4.高表达CGRP对RAW264.7免疫调节及破骨分化的影响1)加入 1μg/ml LPS 刺激 RAW264.7 细胞 24h,提取 RNA,Realtime PCR 检测结果显示,c-raw炎症因子IL-1β、iNOS mRNA表达水平低于raw(P<0.05);Western Blot结果显示CGRP对LPS诱导的NF-κB通路的活化具有明显的抑制作用。2)30ng/mlRANKL 诱导 RAW264.7 1w,Realtime PCR、Western Blot 检测结果显示:c-raw组的CTSK、c-FOS、NFATc-1 mRNA和蛋白水平均低于raw组(P<0.05)。结论:1.高表达CGRP基因可以促进1μg/ml LPS炎症环境下rBMSCs的增殖、降低1μg/ml LPS诱导的炎症因子IL-1 β和TNF-α的mRNA表达水平和蛋白分泌水平、促进1μg/ml LPS炎症环境下rBMSCs的成骨分化。在LPS处理的大鼠牙周骨缺损模型中,高表达CGRP基因可显著提高rBMSCs在LPS处理的骨缺损区抑制炎症浸润及促进骨修复再生的能力。2.高表达CGRP基因可以通过抑制LPS诱导的NF-κB通路的活化降低RAW264.7中炎症因子IL-1β和iNOS mRNA表达水平,高表达CGRP基因可降低RANKL诱导的RAW264.7的破骨相关因子的表达。