论文部分内容阅读
储粮中昆虫与真菌毒素之间的关系是储粮生态系统中生态因子之间相互关系的重要内容,研究储粮昆虫对真菌毒素的适应性及机制具有重要的生态学意义。米扁虫Ahasverus advena（Waltl）能以粮粒表面霉菌的菌丝和孢子为食,并可在含真菌毒素的环境中存活,目前关于其对真菌毒素的适应能力和机制缺乏报道。本论文研究了米扁虫取食黄曲霉毒素B1（AFB1）含量分别为0 mg/kg、2.5 mg/kg、12.5 mg/kg、62.5 mg/kg、250 mg/kg、312.5 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg、1562.5 mg/kg、2000 mg/kg、4000 mg/kg、8000 mg/kg和16000 mg/kg食料后的发育历期、存活率和繁殖力;测定了米扁虫幼虫和成虫取食AFB1含量分别为0 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg、2000 mg/kg、4000mg/kg、8000 mg/kg和16000 mg/kg的食料48 h后体内抗氧化酶、解毒酶和消化酶的活性及MDA、GSH的含量;检测了取食AFB1含量分别为0 mg/kg和1671 mg/kg的食料后米扁虫幼虫和成虫的转录组水平;比较了在AFB1含量分别为0 mg/kg、842 mg/kg和1671 mg/kg的食料中培养得到的不同虫期试虫中候选内参基因表达稳定性,并探讨了相关基因的表达水平和功能;测定了密度分别为15头/kg、45头/kg和135头/kg的米扁虫幼虫和成虫对玉米中AFB1含量的降低效果。主要结果为:（1）当食料中AFB1含量为1562.5 mg/kg时,米扁虫卵到成虫的发育历期从对照组的20 d延长至24 d,主要表现为幼虫期延长,卵期和蛹期无显著变化。食料中AFB1含量为2.5 mg/kg时,米扁虫幼虫经历3次蜕皮后化蛹的个体消失,经历4次蜕皮的龄数比率从对照组的41%降低至31%,经历5次蜕皮的龄数比率从对照组的39%增加至79%。食料中AFB1含量在500 mg/kg及以上时,1日龄幼虫、5日龄幼虫和10日龄幼虫的存活率比对照组降低13%以上。米扁虫成虫取食AFB1含量为1000 mg/kg及以上的食料60 d后存活率比对照组降低9%以上。AFB1对米扁虫1日龄幼虫、5日龄幼虫和成虫的LD50分别为1671 mg/kg、2696 mg/kg、5768 mg/kg。当食料中AFB1含量在500mg/kg及以上时,米扁虫繁殖产生子代的数目比对照组减少20%以上。（2）幼虫取食AFB1不同含量的食料后,其体内SOD（7～10%）、CAT（27～33%）、POD（45～62%）、GSH-Px（14～28%）、GST（50～88%）、P450s（54～138%）、Ach E（71～132%）和海藻糖酶活性（36～41%）及MDA（107～125%）含量均比对照组显著增加;成虫取食AFB1含量不同食料后,其体内SOD（12～16%）、CAT（15～17%）、POD（45～55%）、GR（15～43%）、GSH-Px（48～189%）、GST（102～154%）、P450s（91～213%）、Ach E（49～100%）和海藻糖酶（14～38%）活性及MDA（71～150%）含量均比对照组显著增加。取食AFB1不同含量食料后,幼虫（20～58%）和成虫（41～78%）体内GSH含量比对照组显著降低。成虫取食AFB1含量低于1000 mg/kg的食料后蛋白酶活性显著升高（12～28%）,而在AFB1含量为8000 mg/kg和16000 mg/kg时蛋白酶活性均显著降低16%。而取食AFB1不同含量食料对米扁虫体内淀粉酶和脂肪酶活性无显著影响。（3）通过转录组测序共得到2.2千万条左右的raw reads,所得碱基总量约为31.34 Gb。最终得到119090条unigenes,长度在201～36847 bp,平均长度为718 bp。将unigene与Nr、Nt、KO、GO、Swiss-prot、Pfam和KOG七大数据库做比对注释,发现至少在一个数据库中被注释到的unigene有56224条,占总unigene数目的47.2%,在七大数据库中都注释到的unigene有5492条,占总unigene数目的4.6%。在幼虫和成虫样品中得到的差异表达基因分别有2768个和719个,共同差异表达基因有82个,对所得差异表达基因通过GO注释、Nr比对和KEGG代谢通路分析,得出4类与AFB1代谢相关基因的表达量发生变化:（a）phase I酶相关基因（编码P450s基因）;（b）phase II酶相关基因（负责编码各种转移功能蛋白质基因如GST基因）;（c）氧化还原过程相关基因;（d）细胞凋零和脂肪酸代谢等相关基因。对于米扁虫不同虫期中qRT-PCR分析适合的内参基因,在5日龄幼虫中为RPS27、α-tub、EF1-α和GAPDH,在10日龄幼虫中为β-actin、RPS27、GAPDH和α-tub;在蛹中为GAPDH、RPS3、RPS27和G6PDH;在成虫中为RPS27、GAPDH、RSL40和EF1-α;在所有样品中为RPS27、GAPDH、β-tub和α-tub。其中RPS27和GAPDH为不同虫期适合的候选内参基因中所共有,在13个候选内参基因中表达较稳定,可作为米扁虫不同虫期qRT-PCR分析的内参基因。以RPS27为内参基因,通过qRT-PCR分析发现Aa CYP304A1、Aa CYP4D2和Aa GSTs1在蛹期和10日龄幼虫中表达量较高,在5日龄幼虫和成虫中表达量相对较低。在含AFB1食料中培养得到的不同虫期米扁虫中这3个基因的表达量显著增加,AFB1含量为842 mg/kg时在5日龄幼虫、10日龄幼虫、蛹和成虫中,Aa CYP304A1的相对表达量分别增加1.9倍、1.7倍、5.9倍和24.4倍;Aa GSTs1的相对表达量分别增加3.3倍、2.9倍、3.5倍和31.3倍;Aa CYP4D2的相对表达量分别增加1.5倍、0.8倍、2.0倍和26.7倍。幼虫取食含ds304A1、ds GST和ds4D2的食料3 d后,Aa CYP304A1、Aa GSTs1和Aa CYP4D2的表达量分别比对照组降低了49%、56%和36%。米扁虫幼虫取食ds RNA后在AFB1含量为1000 mg/kg的食料中继续培养至羽化,存活率从对照组的57%分别降低至28%、23%和40%。（4）破碎粒率5%的玉米接入幼虫15头/kg、45头/kg和135头/kg后分别经28 d、21 d和14 d样品中AFB1含量开始显著降低,经35 d后AFB1含量从38.8μg/kg分别降至33.5μg/kg、27.1μg/kg和24.4μg/kg。破碎粒率10%的玉米同样密度接入幼虫相应经35 d、21 d和21 d样品中AFB1含量开始显著下降,经35 d后AFB1含量从38.3μg/kg分别降至33.8μg/kg、28.6μg/kg和26.7μg/kg。破碎粒率5%的玉米同样密度接入成虫相应在21 d、21 d和14 d时AFB1含量开始显著降低,经35d后AFB1含量从38.8μg/kg分别降至29.4μg/kg、24.6μg/kg和18.7μg/kg。破碎粒率10%的玉米同样密度接入成虫相应在21 d、21 d和14 d时AFB1含量开始显著降低,经35 d后AFB1含量从38.3μg/kg分别降至30.7μg/kg、26.1μg/kg和22.3μg/kg。接入米扁虫幼虫和成虫最大密度135头/kg时经35 d可使霉菌总数从初始8.6×10~6 cfu/g降低至4.1×10~6 cfu/g以下。综上所述,取食含AFB1的食料后会导致米扁虫发育历期延长、蜕皮次数增加、存活率和繁殖力降低,与其它生物相比米扁虫对AFB1具有较强的适应能力,其对AFB1的适应机制与体内抗氧化酶、解毒酶及消化酶活性增加及Aa CYP304A1、Aa GSTs1和Aa CYP4D2的表达量增加有关。米扁虫接入玉米中后可导致AFB1含量和霉菌总数显著降低,AFB1含量降低程度与虫态、虫口密度、接入时间和破碎粒率含量有关。