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肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157)是近年来发现的重要食源性病原菌之一。它可以通过肉制品传染给人,能够引起人感染性腹泻。病情严重者会恶化为出血性结肠炎等病症。该细菌引起的疾病死亡率较高,感染剂量非常低。有报道称,人类摄入10～100个以上的活菌就可能致病,故建立一种快速、灵敏的检测方法已经变得迫在眉睫,也是预防肉制品引发疾病感染的关键。目前国内外报道关于EHEC O157:H7的检测方法主要分为选择性培养基分离鉴定、PCR检测、ELISA、血清分型检测、免疫磁珠分离法等,但随着食品加工和运输的迅速发展,沿用标准隔夜培养方法分离、富集微生物病原菌,存在一定的缺陷,如处理时间长、杂菌的干扰、假阳性的存在。因而,将样品前处理与检测方法的互相结合,已经成为防范肉制品感染疾病的重要手段。本研究将自主研制的抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体用以制备特异性免疫磁珠,从而建立快速检测EHEC O157:H7的IMS-RT-PCR技术以及制备镧系荧光微球标记的试纸条,最终建立多种快速的检测EHEC O157:H7的方法。试验I 抗EHEC O157:H7单克隆抗体的制备及鉴定利用热酚-水法提取EHEC O157:H7脂多糖(LPS),将水相脂多糖和酚相脂多糖分离,应用酸解法制备O-特异性多糖(O-spectific polysaccharides,O-SP),采用苯酚-浓硫酸法测定O-SP浓度为40 μg/mL。将浓度为2×109 CFU/mL的EHEC O157:H7甲醛灭活后制备全菌免疫原,免疫8周龄雌性Balb/c小鼠。以EHEC O157:H7灭活菌体与O-SP分别作为包被原,用间接ELISA方法依次筛选分泌EHEC O157:H7 O-SP抗体的阳性细胞克隆。然后用腹腔注射腹水法制备单抗,并采用间接ELISA方法测得腹水抗体效价>1:1×106,使用HiTrapTM Protein G纯化柱纯化单克隆抗体后,测得纯化抗体的浓度为1.79 mg/mL。本研究制备的EHEC O157 O-SP单克隆抗体仅与EHEC O157:H7细菌有结合反应,与其它细菌(大肠杆菌种属或者其它种属细菌)均无交叉反应,具备高特异性。可见,本研究制备的单克隆抗体具有良好的特性,为建立EHEC O157:H7快速检测技术奠定了良好的基础。试验Ⅱ 采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中EHEC O157:H7将免疫磁珠分离法(IMS)与实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术相结合,建立一种快速检测肉制品中EHEC O157:H7细菌的方法。将PM 3-50纳米磁珠经3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后,与抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体结合,得到偶联量为150 μg/mg的免疫磁珠。免疫磁珠的最高捕获量为13748.33 CFU/0.2 mg,在肉制品中特异性捕获的最低检测限为2.2 CFU/mL。根据EHEC O157血清型的特异性基因rfbE(GenBank登录号:S83460)设计引物和荧光探针,将IMS与RT-PCR相结合进行检测EHEC 0157。当肉制品中EHEC 0157含量≥1 CFU/g(2.5 g样本),免疫磁珠也能捕获,并通过EC肉汤培养基增殖3 h后,RT-PCR即可成功检测,全程只需6～7 h。IMS-RT-PCR相结合的检测方法,在进一步缩短了检测时间的基础上,再次降低了 EHEC O157:H7的检测限,在防范肉制品源性致病性EHEC O157:H7传染方面具有重要意义。试验Ⅲ 制备镧系荧光微球免疫层析试纸条快速检测EHEC O157:H7用镧系荧光微球标记单克隆抗体制备的免疫层析试纸条,可用于快速、便捷地检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。镧系荧光微球经3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后与抗EHEC O157:H7 O-SP单克隆抗体结合,形成镧系荧光微球标记单抗。镧系荧光微球标记单抗作为示踪抗体,试纸条NC膜(nitrocellulose membrane,NC membrane)的T线包被的抗EHEC O157:H7多抗为捕获抗体,形成双抗夹心法对EHEC O157:H7进行检测。在最优条件下,通过紫外激发出荧光时,本研究制备的试纸条肉眼可见的最低检测限为104 CFU/mL;结合荧光强度读取仪时,该试纸条最低检测限可提高为102 CFU/mL,该检测限相比于胶体金试纸条、ELISA检测方法降低了两个数量级。该试纸条与实验室保存的其它11株菌株均无交叉反应,与从猪肉或猪排泄物中分离的5株EHEC O157分离株均产生良好反应。镧系荧光微球作为标记物的免疫层析试纸条的检测过程简单、快速、敏感性强、特异性强。该试纸条可定量检测EHEC O157:H7的同时,还可以大大缩短检测时间,这将在防范致病性EHEC O157传染方面具有重要意义。