癌症是影响人类生存的重大疾病之一,口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一,它的发生发展是多因素、多阶段的过程。研究表明,细胞的凋亡在口腔癌发生发展过程中起着十分重要的作用。HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白是该领域研究较多的相关蛋白,国内外学者证实HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白在口腔鳞癌中均有异常表达。长期以来,有机荧光一直被用来标记生物大分子以研究各种蛋白质之间的相互作用及对细胞的功能的影响。但是由于有机荧光的一些缺点,例如激发光谱较窄、光稳定性差、荧光寿命短等,限制了其作为标记物在生物分子、细胞、体内生物成像研究中的应用。近年来半导体量子点(Quantum dot, QD)由于其独特的光学性质：激发波长的范围宽且连续分布,而发射波长的范围窄而且对称分布,并且发光度强,有持久的光化学稳定性等使其在生物医学领域的分子、细胞及体内的成像,尤其在肿瘤学的生物成像技术研究中,前景非常广阔。国内外未见利用量子点对口腔鳞癌细胞HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白进行研究报道。第一章利用不同粒径的量子点探针分别对人舌鳞癌Tca8113细胞中HSP90、p53及Survivin蛋白进行的免疫荧光标记成像研究目的利用不同粒径的量子点探针对人舌鳞癌细胞内HSP90、p53和Survivin蛋白进行特异性荧光标记方法1.用激光共聚焦显微镜对量子点(QD525nm、QD565nm及QD655nm)的荧光和形态进行观察。2.细胞培养：选用人舌癌Tca8113细胞。3.细胞接种。4.利用量子点(QD525nm、QD565nm及QD655nm)通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90、p53和Survivin蛋白进行标记,并在激光共聚焦显微镜下进行观察识别。结果1.量子点的形态和荧光特点：在激光共聚焦显微镜下见QD525nm为近圆形的绿色荧光,QD655nm为近圆形的红色荧光,QD565nm为近圆形的橙色荧光。2.量子点QD525nm特异性标记的HSP90在人舌癌Tca8113细胞浆、细胞核均有明显表达,主要分布于胞浆内,表现为绿色荧光。量子点QD565nm特异性标记的P53表现为橙色荧光,核膜及其周边明显表达,核内少量分布。量子点QD655nm特异性标记的Survivin表现为红色荧光,主要分布于胞浆和核膜。第二章量子点与FITC荧光强度、特异性以及光稳定性方面的比较研究目的利用量子点和FITC同时对人舌鳞癌细胞中Survivin和HSP70蛋白进行双重标记荧光成像,并对两种荧光素进行荧光强度、特异性以及光稳定性比较研究方法1.细胞培养、细胞接种：选用人舌癌Tca8113细胞。2.利用量子点与FITC分别标记人舌癌Tca8113细胞内HSP70,对两种荧光素进行荧光强度、特异性比较。3.利用量子点QD联合FITC,通过双重免疫荧光标记法同时对人舌癌Tca8113细胞内Survivin、HSP70蛋白进行特异性标记后观察识别,然后给予长时间连续高强度激发,观测上述荧光图像的变化以及荧光强度值的改变,对两种荧光素进行光稳定性比较。结果1.QD525nm特异性标记的HSP70在人舌癌Tca8113细胞浆、细胞核均有明显表达,主要分布于胞浆内,表现为绿色荧光。与FITC标记组相比较,HSP70细胞亚定位一致,但QD525nm标记的荧光图效果好,背景干净,非特异性染色很少,特异性更好,荧光强度更强。2.在激光共聚焦显微镜下观察到舌癌细胞Survivin、HSP70蛋白均呈高表达。多色通道下所见,可见到3种不同颜色的荧光(黄、红、绿),黄色荧光为红色、绿色荧光重叠,表示该区域2种蛋白均有分布；绿、红色荧光分别为FITC标记的HSP70和QD655nm特异性标记的Survivin蛋白。QD655nm红色荧光在高强度激光连续激发40min 20s 391ms后荧光无明显减弱,而FITC绿色荧光基本淬灭。随着FITC的淬灭,多色通道下所见的3种颜色(黄、红、绿)的荧光也逐渐消退直至变成单色的红色荧光。表明量子点较FITC具有更好的光稳定性。第三章利用多种不同粒径的量子点探针同时对人舌鳞癌细胞中HSP70、HSP90及p53蛋白进行多重标记的初步探索目的利用三种不同粒径量子点同时对人舌癌Tca8113细胞内的HSP70, HSP90以及p53进行特异性多重标记,并通过共聚焦显微镜观察蛋白空间分布和相互作用等情况,初步探索同时多通道高通量实时动态检测细胞内多种蛋白质分子的活动、相互作用和变化规律以及为蛋白质网络研究等提供崭新的技术平台。方法在对HSP70、HSP90蛋白双重标记的基础上进行多重标记1细胞培养：选用人舌癌Tca8113细胞。2细胞接种。3首先用量子点QD525nm和QD655nm,通过双重免疫荧光法同时对人舌癌Tca8113细胞内HSP70、HSP90蛋白进行双重标记。4在双重标记的基础上,再用量子点QD565nm通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内p53蛋白进行标记,并在激光共聚焦显微镜下进行观察识别。结果在激光共聚焦显微镜下观察到舌癌细胞HSP70、Survivin和HSP90蛋白均呈高表达。多色通道下可见到5种不同颜色的荧光(黄、红、绿、橙及暗红),暗红色荧光为绿、橙、红色三种荧光重叠而形成的,主要分布于细胞核内及核周边,表示该区域HSP70、HSP90及p53这三种蛋白均有分布；黄色荧光为红、绿色荧光重叠而形成,主要分布于细胞浆内,表示该区域HSP70、HSP90这两种蛋白均有分布；绿色荧光为QD525nm标记的HSP70,主要分布在胞浆内,胞核内亦有分布；红色荧光为QD655nm标记的HSP90,主要分布在胞浆内,胞核内少量分布。橙色荧光为QD565nm标记的P53,主分布于核膜及其周边,核内也有少量分布。第四章利用量子点探针观测人舌鳞癌Tca8113细胞热刺激前后HSP70动态变化的研究目的利用量子点探针对人舌癌Tca8113细胞内的HSP70进行特异性荧光标记,并通过共聚焦显微镜观察分析细胞在室温和经43℃加热30min后的细胞内HSP70蛋白的动态变化及空间分布,并与FITC作比较。方法1.细胞培养：选用人舌癌Tca8113细胞。2.细胞接种。3.加热处理：待细胞长满至80%后,将实验组转移置水浴箱中43℃加热30min后,37℃恒温继续孵育,然后分别于加热后2h、4h、6h、8h以及10h取出,对照组直接37℃恒温孵育取出。4.利用量子点QD525nm通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内HSP70蛋白进行标记,并在激光共聚焦显微镜下进行观察识别。5.利用异硫氰酸荧光素(FITC),通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内HSP70蛋白进行标记,并激光共聚焦显微镜下进行观察识别。6.激光共聚焦显微镜观察时的参数设置：激发光谱波长488nm,用Image-Pro Plus图像分析软件测量量子点QD525nm和异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光信号强度,利用SPSS13.0软件进行统计分析实验所得数据用X±s表示,两样本均数比较采用t检验。结果1.QD525nm标记的实验组肉眼即可发现Tca8113细胞受热后2h细胞内HSP70的表达就开始有明显的升高,6h达到高峰,并且有向核内聚集的趋势,10h回复到加热前的水平。然而FITC标记的各组肉眼未能发现明显的荧光强度的改变,只有4h、6h较0h组稍有增强,但变化没有QD525nm标记的实验组明显。2.定量分析发现：利用QD525nm标记的HSP70的表达量在加热后2h就有显著的增加(P<0.05),4h则出现一个表达的小低谷,但荧光强度与Oh还是有显著性差异(P<0.05),6h荧光强度达到高峰,然后8h开始逐渐削弱,到了10h与0h没有显著性差异(P>0.05),恢复到加热前的水平。然而利用FITC标记的HSP70的表达在加热后4h才有显著的增加,未发现有一个低谷的出现,6h荧光强度达到高峰,然后8h开始逐渐削弱,到了10h恢复到加热前的水平。全文结论：1.量子点荧光标记技术能对口腔鳞癌细胞内HSP70, HSP90, p53及Survivin蛋白进行特异性的标记。2.量子点较传统的有机荧光光强度更高,特异性更好,光稳定性更强,不易漂白或光解,适合长时间检测。3.量子点能同时对细胞内的三种蛋白进行多重标记的免疫荧光成像研究,且适合长时间的动态观察4.量子点能对细胞内HSP70蛋白进行热刺激前后的长时间的动态观察以及定位定量分析。