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目的探究在异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导的心肌肥大疾病模型中,环状RNA circNfix发挥的调控作用及作用机制。方法(1)使用circNfix反向引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序,检测其环状结构以及成环位点。用Phylop进行物种间保守性分析。核酸外切酶(RNase R)耐受实验验证circNfix的成环稳定性。(2)为了探究circNfix的功能,ISO诱导SD大鼠原代心肌细胞肥大,实时荧光定量PCR(quantitative-time PCR,qRT-PCR)实验检测circNfix在心肌细胞中的表达量;后进行过表达和敲低实验,通过qRT-PCR实验检测心肌细胞肥大指标B型脑钠肽(BNP)和心肌肌球蛋白重链(β-MHC)的表达量,并通过鬼笔环肽染色实验分析心肌细胞表面积。在动物实验中,8周龄C57BL/6小鼠转染circNfix的过表达载体,1周后通过ISO诱导建立小鼠心肌肥厚动物模型,采用心脏超声和苏木精-伊红(HE)染色观察circNfix转染后心功能的变化,并检测BNP和β-MHC在小鼠心脏中的表达量。(3)采用蛋白免疫印记实验(Western blot,WB)检测circ Nfix过表达和敲低时丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)蛋白的磷酸化水平。结果(1)circNfix的鉴定结果:使用circNfix反向引物进行PCR扩增实验,发现以cDNA为模板可以得到扩增产物,但是以基因组DNA(gDNA)为模板无法得到扩增产物,证明circNfix存在环状结构,Sanger测序证实circNfix成环位点处序列正确。在人、大鼠和小鼠中,circNfix具有较好的保守性。circNfix与线性mRNA相比,RNase R处理后表达量没有显著改变。(2)circNfix在心肌肥大中的调控作用:circNfix在ISO诱导的心肌肥大中表达量显著下调,转染circNfix过表达载体后,心肌肥大指标BNP和β-MHC表达量下降,鬼笔环肽染色显示心肌细胞表面积缩小;敲低circNfix则作用相反。在体内实验中,过表达circNfix组的心脏超声显示,短轴缩短率明显升高,左室舒张末内径明显降低,qRT-PCR结果显示BNP和β-MHC表达下调,心脏HE染色显示,细胞体积明显缩小。(3)circNfix对p38MAPK/CREB信号通路的影响:Western Blot实验显示,心肌肥大时p38MAPK和下游分子CREB的磷酸化水平上调,而过表达circNfix时会抑制p38MAPK和CREB的磷酸化,敲低circNfix时促进p38MAPK和CREB蛋白的磷酸化。结论利用ISO诱导建立心肌肥大疾病模型,探究circNfix在心肌肥大中的作用,实验结果表明:(1)circNfix是具有稳定环状结构的环状RNA,且在ISO诱导的心肌肥大中表达下调。(2)circNfix负向调控原代心肌细胞肥大和小鼠心肌肥厚。(3)circNfix可以抑制p38MAPK和CREB蛋白磷酸化。