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水稻（Oryza sativa L.）是一种全球范围内种植的兼性短日照植物。禾本科植物开花又称抽穗,水稻抽穗期作为重要的农艺性状之一,能够直接影响植株产量和品种地域适应性,因此,研究其影响因素与调节机制并使植株在适宜的种植地和时间抽穗具有重大意义。水稻抽穗期作为一个复杂的数量性状,受内在基因网络和外界光温等因素的共同调控。目前,已经鉴定和克隆出多个控制抽穗期的关键基因,并发现蛋白激酶在调控抽穗期分子机制中能够发挥重要作用。在水稻中,Hd16（Heading date 16）/EL1（Early flowering 1）编码酪氨酸蛋白激酶CKI,是一种在长日照条件下抽穗负调节因子。已有研究表明Hd16能够通过磷酸化Hd4/Ghd7（Grain number,plant height and heading date）抑制Ehd1（Early Heading Date1）、Hd3a（Heading date 3a）、RFT1（Rice flowering locus T 1）的表达从而使水稻在长日照条件下晚花。hd16突变体在长日照下表现出早抽穗表型,而短日照条件下表型及功能尚未明确;Hd16还能够与Os PRR37/Hd2（Oryza sativa Pseudo-Response Regulator37/Heading date 2）互作且磷酸化Os PRR37/Hd2的中段和C端,但其确切的磷酸化位点有待鉴定;蛋白激酶具有底物广谱性,那么除了已知的Hd16磷酸化底物,是否还有新的磷酸化底物与Hd16互作并与之形成调控水稻抽穗期新途径尚未可知。因此,本实验室前期在EMS诱导的突变体库中发现两个具有长日照提前抽穗,短日照推迟抽穗表型的突变体,经Mutant Map确定其Hd16基因发生改变。本研究通过d Caps鉴定出两个Hd16新的等位基因,并利用CRISPR-Cas9手段获得纯合突变体进一步确定Hd16在短日照条件下的表型,利用遗传学证据明确Hd16与Hd2上下游关系,同时利用酵母筛库、Co-IP质谱分析的方法尝试寻找Hd16新的互作底物,以期探究编码酪氨酸激酶基因Hd16调控水稻短日照抽穗期的分子机制。得到结果如下:1.hd16突变体呈现长日照早花短日照晚花的表型在EMS诱导产生的突变群体中发现了两个在长日照条件下早花,在短日照条件下晚花的点突变材料,Cap和d Caps鉴定结果表明,SNP-1位于Hd16的第9个外显子激酶活性结构域,由丙氨酸（Ala）变为缬氨酸（Val）;SNP-2位于Hd16的第15个外显子,由苏氨酸（Thr）变为异亮氨酸（Ile）。蛋白序列比对发现这两个位点均非常保守。进一步利用CRISPR-Cas9技术敲除Hd16基因经过多年繁育获得了hd16纯合突变体,通过表型鉴定发现hd16突变体在长日照条件下早花,在短日照条件下晚花。2.Hd16过表达转基因植株呈现长日照早花短日照晚花的表型构建了融合Flag标签的Hd16（p GWB12-Hd16）过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化法侵染日本晴（Nipponbare）愈伤组织,并通过实时荧光定量PCR（Realtime PCR）与Western Blot杂交检测从转录和蛋白水平对4个稳定的株系进行了检验,获得了Hd16过表达转基因植株。表型鉴定发现,Hd16过表达植株在长日照条件下提前抽穗而在短日照下延迟抽穗。3.Hd16定位在细胞核并通过酵母双杂筛选到了与其互作的蛋白将Hd16的完整编码区（CDS）序列连接到融合了绿色荧光蛋白GFP的Gateway系统载体p H7WGF2.0上,通过烟草瞬时表达系统对Hd16的亚细胞定位进行检测,结果发现Hd16定位于细胞核。进一步通过酵母双杂交筛库实验,初步筛选到了4个可能与Hd16互作的候选蛋白,酵母双杂点对点验证发现除已报道的Hd2,只有候选蛋白Os PP2A-1与Hd16存在微弱的互作,但通过烟草萤光素酶互补实验（LCI）发现不存在体内互作,因此没有进一步深入研究。4.Hd16通过结合Hd2调控水稻在短日照条件下的抽穗期因在酵母筛库中筛选到已报道与Hd16互作的Hd2,故通过酵母点对点实验验证了Hd16和Hd2的互作。为了确定它们的遗传学关系,通过hd16和hd2单突及双突的表型遗传分析,确认在短日照下,Hd2依赖于有功能的Hd16促进抽穗。而为了寻找未知的Hd16磷酸化Hd2的具体位点,利用GPS 5.0-Kinase-specific Phosphorylation Site Prediction网站预测了可能性较大的磷酸化位点,并将进一步体内外蛋白磷酸化实验来验证,最终通过定点突变转基因植株来证实。5.利用免疫共沉淀与质谱分析（IP-MS）鉴定了与Hd16互作的候选蛋白利用从Hd16过表达转基因植株中提取的融合Flag标签目的蛋白进行免疫共沉淀（Co-IP）实验,并将考马斯亮蓝染色后的SDS-PAGE胶条送至公司进行质谱分析（Mass Spectrometry,MS）,通过IP-MS鉴定到了56个可能与Hd16互作的蛋白,通过肽段数及蛋白功能等数据进行综合分析后确定了4个候选蛋白做进一步验证。本研究确定在短日照条件下Hd16对水稻抽穗期的促进作用,并尝试解析其功能机制,为完善水稻抽穗期调控网络与调节水稻品种地域适应性提供理论依据和实践指导。