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人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)是一种双链DNA病毒,属于?-疱疹病毒属,可经过血液传播,性传播,母婴传播,器官移植传播等途径传播,人群普遍易感。HCMV感染机体后可终身潜伏于宿主体内,健康个体感染后通常处于潜伏状态,极少引起临床症状,一旦被激活,尤其是在免疫功能低下的个体,将会导致严重的疾病以及并发症。先天性HCMV感染可导致新生儿耳聋、智力缺陷甚至死亡,是影响出生人口素质的重要因素之一。然而,由于目前尚无有效的治疗方法并且没有合适的疫苗,HCMV防治一直困扰着临床工作者,也引起了众多学者的关注和研究。HCMV潜伏感染的细胞比例非常低,并且HCMV具有高度的种属特异性,极大限制了HCMV感染的研究进程。HCMV之所以能够长期潜伏于宿主体内而不被清除是由于其强大的逃避宿主免疫监视的功能。HCMV一方面可编码多种蛋白质,如HCMV所编码的立即早期基因产物IE1和IE2可干扰IFN的信号途径,IE1和STAT2结合抑制干扰素刺激基因因子3复合物(Interferon-Stimulated Gene Factor 3,ISGF3)与ISG启动子结合;IE2阻止了转录因子NF?B和IFN-β启动子结合,导致IFN-β表达下调,抑制了IFN的杀灭作用。另一方面HCMV还可编码多种mi RNA,研究表明,HCMV所编码的miRNA在免疫逃逸中也发挥着重要的作用,通过作用于相应的靶mRNA而抑制机体的免疫杀伤作用。但是,目前报道的miRNA多在HCMV裂解感染状态下发现,那么在潜伏感染状态下,HCMV是否也编码众多miRNA以及其如何发挥免疫逃逸的功能机制还有待进一步探讨与研究。本课题的研究目的是构建hcmv潜伏感染的细胞模型,并在此基础上探讨hcmv潜伏感染状态下所编码的mirna及其分子机制和生物学功能。研究结果如下:一、hcmv潜伏感染细胞模型的建立。通过hcmv感染thp-1细胞,检测病毒拷贝数、hcmv基因组和转录基因组的变化情况,观察thp-1细胞是否发生裂解。并将hcmv潜伏感染thp-1细胞30天,分为直接感染组和先诱导再感染组。hcmv基因组和转录基因组的变化说明建立起hcmv潜伏感染的细胞模型。免疫荧光检测裂解性感染、未分化感染及分化感染细胞pp65蛋白的表达情况也说明,该模型可以满足hcmv潜伏、激活的特性,并且不造成细胞损伤。二、hcmv潜伏感染状态下亦可编码多种mirna。采用高通量solexa测序平台,对潜伏感染的hcmv细胞模型进行深度测序,发现hcmv在感染状态下亦编码mirna,可见在潜伏感染状态下,hcmv表达了mir-us25-2-3p、mir-us25-2-5p、mir-ul112、mir-us25-1、mir-ul22a以及预测为mirna的长度为25bp的pc-5p-148467。对编号为pc-5p-148467进行系列分析,利用生物信息学方法发现该序列具有形成mirna所具有的发卡结构以及保守性,再根据其基因定位和mirna命名规则,将其命名为hcmv-mir-us33as-5p。三、hcmv-mir-us33as-5p的潜在靶标之一为ifnar1(interferon-alpha/betareceptor)。利用生物信息学软件对mir-us33as-5p的靶标进行预测,构建预测靶标的双荧光素酶报告系统,检测到mir-us33as-5p可导致含infar13′-utr的萤火虫酶的活性下调。构建ifnar1和mir-us33as-5p种子结合区域的突变及回复突变表达质粒,筛选稳定表达的293细胞株,双荧光素酶报告实验再次证明ifnar1是hcmv-mir-us33as-5p的潜在靶标之一,也说明了mir-us33as-5p和其靶标ifnar1的主要结合位点。四、ifn和ifnar1结合后,激活jak-stat1信号转导途径,刺激下游isgs的释放,进而发挥抗病毒的作用。构建ifnar1-rnai质粒稳定转染293细胞,比较所有稳定表达细胞株p-stat1蛋白表达情况、stat1核转移情况以及isgs的相对定量表达情况,均相应上调和下调。为了进一步从反面验证,构建含有anti-us33as序列(hcmv-mir-us33as-5p抑制序列)的慢病毒,稳定转染成纤维细胞,发现转染anti-us33as慢病毒可解除mir-us33as-5p对ifnar1的抑制作用。研究结果表明,hcmv编码的mir-us33as-5p可以靶向竞争结合ifnar1,阻断jak-stat1信号转导通路,减少isgs的释放表达,从而抵御机体的免疫杀伤作用。综上所述,本研究成功构建了hcmv潜伏感染的细胞模型,有望为hcmv潜伏感染的研究提供依据;证实了HCMV在潜伏感染状态下亦编码miRNA,发现了HCMV-miR-US33as-5p;通过生物信息学方法和分子生物学技术相结合,证明了IFNAR1为miR-US33as-5p的潜在靶标之一;正是由于miR-US33as-5p与IFNAR1结合,致使机体IFN的免疫杀伤作用无法有效进行,从而可以长期潜伏于宿主体内。本文确认了HCMV潜伏感染中新发现的HCMV-miR-US33as-5p的靶标及阐述其生物学功能和免疫逃逸机制,从而有助于增加对HCMV免疫逃逸机制新理解,发现新的预防和治疗靶标,开发新的抗HCMV抗病毒药物,开拓新的前景。