癫痫是常见的中枢神经系统疾病,发病率高达4‰～7‰,目前我国约有癫痫患者一千万,其中2／3为儿童。反复的癫痫发作势必引起致残甚至危及生命。癫痫疾病分型有多种。常染色体显性遗传夜间发作性额叶癫痫(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE)是一种常染色体显性单基因遗传病,通常儿童期起病,症状持续至成人期,男女发病率相似。发作与睡眠关系密切,其临床特征为夜发性、丛集性、短暂性的运动性发作。ADNFLE在大多数已知家系的遗传外显率多为70-80%或更低,同时也可见于散发病例。散发患者和家系病例都有着相似的临床和脑电图特征。家族间、家族内的临床表现复杂性和严重性差异很大,从遗尿到猛烈的过度运动均有可能发生。患者的神经系统体查及头颅CT、MRI影像学检查基本正常。ADNFLE的诊断主要依据临床发作特点,辅助检查常缺乏特异性指标,ADNFLE由于多为夜间发作不易觉察,易被临床误诊或延误治疗,导致反复癫痫发作势必引起智残、甚至危及生命。因此对ADNFLE病例深入研究具有现实意义。目前,寻找ADNFLE的致病基因,探讨其发病机制,已成为神经医学界的一个研究热点。ADNFLE是首个被发现有明确基因变异遗传背景的特发性家族性部分性癫痫。近十余年的国外研究提示ADNFLE的发生与编码烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚基的基因突变有关,但存在一定的种族差异。目前已有三个nAChR的α4、β2、α2亚单位编码基因(CHRNA4、CHRNB4、CHRNA2)先后被鉴定。至此,nAChR的多个亚基基因与ADNFLE发病密切相关已是不争的事实。CHRNB2基因是第二个被发现与ADNFLE相关的乙酰胆碱受体亚单位基因,CHRNB2基因的已知突变仅见于为数不多的不同种族家系病例,尚未在散发病例中报道发现。目前已在8个家系中发现5种错义突变：V287L(意大利),V287M(苏格兰、西班牙),I312M(瑞士、韩国),L301V(土耳其),V308A(苏格兰、英格兰)。以上5个已知错义突变(V287L、V287M、I312M、L301V、V308A)均位于CHRNB2第5外显子,分别位于编码受体疏水跨膜区TM2或TM3。电生理功能研究显示突变受体对乙酰胆碱的敏感性增加,离子通道的脱敏延迟以及对受体的钙依赖性下降,这些都可能触发癫痫发作.在近十余年间,已超过一百个家族病例相继被研究报道。然而,发现明确基因突变的ADNFLE家系仅占全部ADNFLE家系的10%。ADNFLE的临床表型与基因表型关系仍未明确,不同种族间相同临床表型的ADNFLE患者存在遗传异质性。家族间、家族内的临床表现复杂性和严重程度差异很大,同一家族同一突变不同个体表型也千差万别。临床上还存在一些散发的夜间发作性额叶癫痫病例,其临床、神经电生理特征及预后与ADNFLE没有明显区别,唯缺乏家族性发病特征。尽管散发病例与家系病例被猜测或许有着相同的遗传背景,但目前绝大部分已知nAChR基因突变仅存在于少数家系患者中,而在散发病例罕有发现。迄今散发病例先后有2例发现CHRNA4基因突变,但尚未在CHRNB2和CHRNA2基因中发现明确变异。其中的1例携带CHRNA4的S256L为黎巴嫩血统散发患者,随后被证实为家系病例。近年中国报道首例散发患者在CHRNA4发现一错义突变R308H。然而,国内鲜有ADNFLE家系报道,多为散发病例,正是由于缺乏特异性诊断指标,给诊断和鉴别诊断带来较大困难,因此严重地威胁患儿的健康和生命安全。尽管目前已知本病为常染色体显性遗传,但人们对这种癫痫发作了解甚少,究其原因主要为ADNFLE的发病机制尚未完全阐明。国内对该病的报道研究还主要处于临床水平,如临床表现特征,脑电图等辅助检查的综合分析等,对该病相关分子生物学研究仍较薄弱,缺乏大样本ADNFLE基因筛查研究。我国ADNFLE人群是否与目前国外研究的遗传背景一致值得进一步深入探讨。前期我们收集了中国汉族人群的106个患者,包括74个散发病例以及来自8个非亲缘性家族的32个家系患者,并已应用PCR产物直接测序方法进行了CHRNA4基因突变筛查未能发现已知突变,本研究将重点选取CHRNB2基因进行突变筛查,进一步寻找中国人群ADNFLE的致病基因,探索ADNFLE患者CHRNB2基因多态性的特征,阐明中国人群ADNFLE发病的分子机制。可为ADNFLE的发病机制和遗传基础提供科学依据和新靶点,建立起为患者家系提供遗传咨询和早期诊断或产前诊断的基因诊断方法体系,从而促进ADNFLE的早期防治；通过生物工程手段阻止或者修复突变所造成的危害,针对该种疾病中的热点突变或易感基因位点开发新型药物,从而促进ADNFLE的有效治疗。这对于有效地治疗和控制ADNFLE发作,改善患儿生活质量,提高人口素质等具有深远的意义。[对象和方法]1.对象：参照国际抗癫痫联盟2001年癫痫和癫痫综合征的分类诊断标准并结合临床特点诊断,收集2006年1月～2008年12月期间我院门诊或住院收治确诊中国南方人群汉族ADNFLE患者共106例,包括8个家系中现存患者32人,散发病例74人。对照组纳入本地健康人群200例,均为汉族,各项检查均未见异常。2.临床资料收集：全部患者均完善视频长程脑电图、头部MRI检查,建立ADNFLE病人资料库,制定和采用统一的调查表和方法,进行家系调查、资料收集和处理。3.CHRNB2基因突变筛查：(1)全部106例ADNFLE患者及200例健康对照人群均抽取200μl外周静脉血液,提取基因组DNA。(2)根据CHRNB2基因组标准序列,设计扩增全部外显子的PCR引物,全部病例标本采用PCR特异性扩增CHRNB2基因的1～6外显子片段。(3)对PCR产物进行纯化,采用ABI3730测序仪进行测序。应用Vector NTI8.0分析软件分析测序结果,并与GenBank中的标准序列进行比对,确定可能的突变位点后,扩增200例健康对照组的相应基因片断进行比对,确定新发现的突变点,除外基因的多态性。如确定为突变位点,则采用上述方法对先证者家族成员进行突变筛查。[结果]1.本研究里共收集8个ADNFLE家系,总发病人数35例,男17例,女18例,男：女约为1：1；存活患者32例,包括先证者8例,平均发病年龄5.5±0.5岁,每个家系患者≧3,简单分离分析表明该遗传模式属于常染色体显性遗传。散发病例共74例,男42例,女32例,男：女约为1.3：1,平均发病年龄12.7±0.8岁。所有患者临床表现均符合夜间额叶癫痫诊断标准,脑电图多发生在非快速眼动相(non-REM)的第二阶段,异常脑电图多为一侧或双侧额区痫样电活动或局限性慢波增多。大部分患者对卡马西平、奥卡西平,丙戊酸钠及托吡酯等抗癫痫药治疗效果良好。2.实验组共106例患者全部顺利完成CHRNB2基因突变筛查,结果显示在所有家系患者和散发患者中均未发现迄今已报道的CHRNB2的5个热点突变(V287L、V287M、I312M、L301V、V308A)。3.在一个散发病例中新发现CHRNB2基因的杂合子同义突变H161H(c.483C>T),位于CHRNB2基因第5外显子,并不引起所表达编码区第161氨基酸变化(His)。该变异也在患者健康母亲中证实存在,随后的200例健康对照结果均显示阴性。另一散发病例中发现核苷酸多肽c.1407C>G也为杂合子变异,位于CHRNB2基因第6外显子同样未引起表达氨基酸改变(Val),然而在2／200例健康人亦同时存在。[结论]1.我们采用候选基因突变筛查的策略,对本研究的106例患者(包括8个家系患者32例,散发患者74例)应用PCR产物直接测序方法,顺利扩增了CHRNB2全部1～6外显子序列,结果显示未能发现至今已报道的基因突变。这提示CHRNB2很可能不是中国南方人群ADNFLE患者的主要致病基因,进一步证实ADNFLE具有明显的遗传异质性。2.我们在两个散发病例中各新发现一同义突变H161H (c.483C>T)和单核苷酸多肽c.1407C>G,以上两种变异均未在国内外报道。杂合子同义突变H161H(c.483C>T)虽未改变CHRNB2的编码氨基酸序列,但是否对mRNA的转录产生影响或对nAChR受体功能影响,与ADNFLE发病相关性仍有待进一步研究。而单核苷酸多肽改变c.1407C>G也表现为杂合子变异,健康人群中可见,并非引起ADNFLE致病的潜在因素。