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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区重要的海水养殖蟹类,具备高营养价值和经济价值,但在养殖过程中容易遭受各种病害侵袭。近几年来,为了更好地进行病害防治,人们对青蟹自身免疫机制的研究逐渐增多。组织蛋白酶是一类溶酶体蛋白酶,广泛参与机体的各种生理过程,包括细胞内蛋白质降解、酶原和激素原的激活、免疫调节、炎症反应、细胞外基质重塑等,因此探索拟穴青蟹组织蛋白酶的功能特性对于深入了解甲壳动物先天性免疫防御机制具有重要意义。目前对于组织蛋白酶的研究多集中于哺乳动物,而对于无脊椎动物尤其是甲壳动物组织蛋白酶的研究还非常少。本课题组在前期研究工作中利用拟穴青蟹胚胎转录组筛选获得组织蛋白酶B、L、D的同源基因片段,分别命名为SpCathB、SpCathL和SpCathD。本论文主要研究成果如下:1.克隆获得了 SpCathB、SpCathL、SpCathD 的开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列并进行生物信息学分析。三种组织蛋白酶的一级结构都是由信号肽、前体肽和成熟肽组成,其中SpCathB和SpCathL属于半胱氨酸蛋白酶而SpCathD属于天冬氨酸蛋白酶。SpCathBORF序列全长999bp,编码322个氨基酸残基,预测有三个半胱氨酸蛋白酶活性位点;SpCathLORF序列全长1029bp,编码342个氨基酸残基,预测有三个半胱氨酸蛋白酶活性位点;SpCathD ORF序列全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,预测有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点和一个非消化性组织蛋白酶D特征序列。2.揭示了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在正常机体的组织分布特性以及在机体受到副溶血弧菌和LPS感染后的基因表达变化模式。结果表明SpCathB、SpCathL、SpCathD的表达特性十分相似,在正常雌、雄蟹所采集的各个组织中均有不同程度的表达,其中肝胰腺和中肠的相对表达量较高。在机体遭受副溶血弧菌感染或LPS刺激后,SpCathB、SpCathL、SpCathD在肝胰腺、中肠和血淋巴细胞三个组织中的表达量均呈现显著下调趋势,说明拟穴青蟹组织蛋白酶可能参与机体免疫反应。3.获得了纯化的真核表达proSpCathL蛋白并测定其酶学性质。利用毕赤酵母表达系统对proSpCathL进行真核表达,利用镍离子金属螯合亲和层析获得其纯化蛋白,研究结果表明proSpCathL表达产物在酸性条件下能够自催化形成约30 kDa的成熟肽。酶活性测定结果证明表达产物具有组织蛋白酶L活性,且测得最适pH为pH 5,最适温度为30℃。4.初步探索了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在细胞凋亡中的作用。共定位实验结果表明,SpCathB、SpCathL、SpCathD在转染入昆虫细胞后均能进入溶酶体。TUNEL检测结果表明,单独转染SpCathB、SpCathL、SpCathD不能直接诱导昆虫细胞凋亡,但将Sp-caspase与SpCathB、SpCathL、SpCathD分别共转染后细胞凋亡的现象增多,说明这三个蛋白可能具有促进细胞凋亡的作用。细胞外实验证明,SpCathL只能降解Sp-caspase蛋白,但不能对其进行催化激活,推测拟穴青蟹组织蛋白酶可能通过其他途径对细胞凋亡产生调节作用。综上,本研究一方面对SpCathB、SpCathL、SpCathD进行了基础的鉴定工作和基本特性研究,包括基因克隆、生物信息学分析、组织分布、细胞内定位、真核表达和酶学性质研究,另一方面对这三个基因在免疫应答和细胞凋亡方面的功能进行了初步探索,发现这三个基因都能够参与机体的免疫响应,并且能够促进细胞凋亡,证明SpCathB、SpCathL、SpCathD是拟穴青蟹体内重要的免疫因子,这为深入研究组织蛋白酶和无脊椎动物免疫系统奠定了理论基础。