目的:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associatedlipocalin,NGAL）是lipocalin家族的新成员,于1993年在人中性粒细胞中被发现。近年来众多研究表明NGAL基因参与若干肿瘤的发生发展,可能是人类的一种重要的癌基因;Goets等的研究还显示在细菌入侵机体后,NGAL可以作为铁载体介导阻碍细菌对铁的捕获,从而抑制细菌的生长,是一种重要的细菌抑制剂;NGAL还参与肾小管上皮发生的及功能调控,对急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）等肾脏功能的诊断价值比传统的AKI实验室指标血肌酐更为快速和准确,是AKI最强有力的预测因子。因此对NGAL基因的检测亦显得尤为重要。本课题研究的目的就是建立NGAL mRNA的荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）检测方法,并将此方法应用于临床结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织NGAL mRNA的检测,初步验证其应用价值。方法:1.根据NGAL基因序列,设计并合成PCR引物,将PCR扩增的特异片段克隆入T载体,重组质粒经筛选、鉴定、定量后作为标准品。2.在上述NGAL扩增片段内部设计FQ-PCR引物,通过正交设计方式对PCR引物浓度、退火温度、SYBR greenⅠ染料(Mg²⁺)浓度等PCR反应条件进行优化,从而建立NGAL mRNA的检测方法。3.将高浓度标准品质粒进行系列稀释,用上述优化的FQ-PCR方法进行检测,以NGAL拷贝数为横坐标,循环阈值为纵坐标绘制标准曲线,用于被测物的绝对定量。4.对该检测方法进行敏感性、特异性及重复性等方法学评价。5.将建立的FQ-PCR用于临床结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织及正常组织NGAL mRNA的检测,其结果与普通PCR相比较。结果:1.成功构建了重组质粒pGM-T-NGAL。2.确立了FQ-PCR最佳反应条件:SYBR 10×Buffer(with Mg²⁺) 2μl、dNTPs0.2mmol/L、上游、下游引物各0.32μmol/ml、SYBR TaqTM 1.25μl、ddH2O15.15μl,退火温度60.0℃。3.制作的标准曲线相关系数为98.9%,无非特异性扩增。建立了以NGALmRNA SYBR greenⅠ染料技术为基础的实时荧光定量PCR方法,其线性检测范围为10²～10⁹ copies/μl;灵敏度为10copies/μl.高拷贝样品的天间CV为3.57%、批内CV为2.95%,低拷贝样品的天间CV为3.24%、批内CV为1.85%;特异性好;4.对临床标木的检测结果与预期设想完全相符。肿瘤组织、癌旁组织正常组织的NGAL mRNA水平呈明显的下降梯度。与普通PCR相比,该检测方法灵敏度要高约100倍。结论:我们成功构建了FQ-PCR检测体系和NGAL mRNA的定量标准品,其快速、灵敏、特异的特点适合临床实验室的应用。为临床NGAL mRNA的快速定量奠定了坚实的基础。