作为我国重要经济油料作物,由于耕地面积有限以及经济效益等原因,花生连作十分普遍。花生连作后结瘤减少,病害频发,产量下降,导致严重的连作障碍。现有缓解连作障碍方法由于可操作性和经济效益等原因而难以实际应用。前期我们发现植物内生真菌枫香拟茎点霉B3 B3)能显著增加花生结瘤固氮并提高花生产量从而克服花生连作障碍。对内生菌克服连作障碍的机理进行初步探究,发现与内生真菌优化花生连作土壤微生物群落结构,调节花生根系分泌物,降解土壤中有害酚酸类化感物质等有关。但是否还有其它重要机理仍不清楚。氮素是花生植物生长的重要元素,花生生长过程中所需氮素主要来源于根瘤固氮、土壤供给、肥料供给三个途径。因此在本研究我们尝试从植物内生菌增加花生根瘤有益内生细菌多样性促进花生结瘤以及改善花生根际土壤固氮菌群落丰度及结构,改善土壤氮素水平两个角度探讨植物内生真菌促进花生结瘤固氮克服连作障碍的潜在机理。豆科植物根瘤中除了能诱导宿主植物结瘤并进行固氮的根瘤菌外,还存在着其他内生细菌,它们虽然不能诱导宿主植物结瘤,但却能进行生物固氮、促进宿主植物结瘤和生长,其生态功能逐渐受到重视。因此我们利用植物诱捕法,通过盆栽试验探究 P.liquidambari B3对连作花生根瘤内生细菌多样性的影响。我们共设置了四个处理,分别为连作土壤种植花生(CK)、非连作土壤种植花生处理(NS)、连作土壤种植花生并且施加植物内生真菌P.liquidambari B3(CSB3)、连作土壤种植花生并施加灭活B3(CSIB3)。在花生花期我们从花生根瘤中共分离出120株根瘤内生细菌,经鉴定它们分别属于变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)三个门,16个属,33个种。其中NS处理中包括3个门、17个种、34个菌株,比只包括1个门、12个种和27个菌株的CK处理多。CSB3处理有3个门、18个种和34个菌株,不仅比CK处理多也比含有2个门、11个种和25个菌株的CSIB3处理多。相关性分析表明,分离得到的16S rRNA基因与土壤pH和总氮显著正相关。本研究首次报导了植物内生真菌对连作花生根瘤内生细菌多样性性的影响,结果表明连作花生根瘤中根瘤内生细菌多样性低于非连作土壤,而施加活性P.liquidambari B3能增加连作土壤中花生根瘤内生细菌的多样性,这可能与P.liquidambari改善土壤环境有关。随后分离得到的根瘤内生细菌33株代表菌株的植物促生长特性被分析,能诱导花生有效根瘤生成的仅有NS-13(Biradyrhzobium cytisi),与NS-13共接种促进花生结瘤的有5株,其中NS和CSB3处理各有3株、CK和CSIB3各1株。共接种时同时促进花生根长茎长和生物量的有13株,其中NS与CSB3均有9株,而CSIB3和CK分别只有3和2株。具有溶磷、产铁载体、产生长素及拮抗病原菌的菌株分别有16、16、11和7种。NS(10)与CSB3(10)处理溶磷菌株相同,其次为CSIB3(5)和CK处理。在所有能产铁载体的菌株中,CSB3处理有11个种,在四个处理中最多,其次是NS处理(10种),CSIB3处理(5种)高于CK处理(4种)。CSB3和NS均包含了 7种产IAA菌株,CK处理有4种,而CSIB3处理仅有1种。在所有拮抗花生病原真菌尖孢镰刀菌的7种菌株中,CSB3与NS处理均有5种菌株,而CK和CSIB3处理分别只有3和1种。以上结果表明,与非连作处理相比,连作导致了花生根瘤有益内生细菌种类的减少,而施加内生真菌B3后,增加了花生根瘤有益内生细菌的多样性,促进了花生的结瘤,这可能是植物内生真菌促进连作花生结瘤的一个重要原因。虽然花生所需氮素的40-50%来源于根瘤固氮,但还有一部分需从土壤中获得。作为生物体从自然界获取氮素的主要途径,生物固氮在农业生态系统中占重要地位。因此我们利用实时定量PCR和T-RFLP技术,研究了 NS、CK、CSB3和CSIB3四个处理中花生苗期、花期和收获期根际土壤固氮菌群落的丰度和结构,发现三个时期NS和CSB3处理花生根际土壤固氮菌群落丰度和固氮菌群落丰度百分数(每克土壤中nifH基因拷贝数16S rDNA拷贝数的百分比)均显著高于同时期的CK和CSIB3处理,且固氮菌群落丰度与土壤总氮呈显著正相关。聚类分析表明,NS和CSB3处理固氮菌群落结构与CK处理相比均具有明显差异,通过对环境因子和根际固氮菌群落进行RDA分析发现,不同时期影响固氮菌群落结构分布的因素不同,在苗期,显著影响固氮菌群落分布的因素为有机质、氨氮、硝氮和总氮,在花期影响群落分布的是pH和氨氮,而在收获期为土壤速效磷、氨氮以及总氮。总之,我们的试验结果表明连作土壤中花生根际固氮菌群落丰度显著低于非连作处理,且群落结构也发生变化,而施加内生菌后能改变土壤中固氮菌群落丰度和结构,增加土壤中氮素含量,这种改变与土壤养分的改变有关,这可能是植物内生真菌能改善土壤氮素水平,为花生生长提供更多氮素,缓解花生连作障碍的另一个原因。