不同乳酸浓度对小鼠RAW264.7细胞的外泌体miRNA表达及破骨向分化的影响

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:z344121483
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目的:通过对单核细胞在乳酸的刺激下产生的外泌体miRNA表达谱进行分析,研究不同乳酸浓度对小鼠单核细胞破骨向分化的影响,为加快骨替代材料的降解成骨提供参考。方法:实验1不同乳酸浓度对小鼠RAW264.7细胞外泌体miRNA表达的影响:分别使用含0m M、5m M、10m M、20m M浓度乳酸的DMEM完全培养基,在50 ng/ml RANKL条件下培养小鼠RAW264.7细胞5天,收集培养上清液,分离外泌体,通过电镜检测、NTA径粒检测、外泌体表面标志蛋白检测鉴定外泌体;提取外泌体中的miRNA进行高通量测序,获得miRNA差异基因表达谱,分析比较不同浓度乳酸条件下外泌体miRNA的表达差异,行差异表达基因初筛、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析;对富集结果中可能影响破骨细胞分化的靶基因相关的生物过程、细胞组分、分子功能以及通路进行初步探讨。实验2不同乳酸浓度的培养条件对小鼠单核细胞破骨向分化的影响:分别用含0,5,10,20 mmol/L浓度乳酸的DMEM完全培养基,在50ng/ml RANKL的诱导下培养小鼠RAW264.7细胞5d,CCK-8法分析乳酸浓度对细胞增殖率的影响。使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒对TRAP阳性多核细胞进行染色和计数。使用RT-PCR技术分析Acp5、Nfatc1、RANK的m RNA的表达情况。使用Western Blot技术分析Ctsk、Acp5、Nfatc1、RANK的蛋白表达情况。结果:实验1:1.与对照组相比,5m M乳酸浓度组外泌体提取的miRNA共检测到142个差异表达的miRNA,其中上调67个,下调74个;10mmol/L乳酸浓度组外泌体提取的miRNA共检测到146个差异表达的miRNA,其中上调64个,下调82个;20m M乳酸浓度组外泌体提取的miRNA共检测到213个差异表达的miRNA,其中上调106个,下调107个。2.在10mmol/L乳酸微环境下,mmu-let-7b-5p,mmu-miR-712-5p和mmu-miR-3084-3p可能是乳酸条件下单核细胞外泌体介导单核细胞破骨向分化的miRNA,mmu-let-7b-5p对应的与破骨分化有关的靶基因最多,可行性最高。3.GO分析和KEGG分析结果显示:与对照组相比,10mmol/L乳酸浓度组差异表达明显的miRNA靶基因与阳离子跨膜运输、线粒体活动以及糖异生的进程有关,影响DNA的转录以及磷酸化等进程。与破骨细胞分化相关的靶基因富集于MAPK、PI3K-Akt、Fox O、AMPK、Jak-STAT以及Hippo通路,未见富集于破骨分化通路。4.乳酸浓度在5~10mmol/L范围内改变时,差异表达的外泌体miRNA可能与靶细胞的产热作用、t RNA转运、核糖体RNA的合成与代谢进程等相关。与破骨细胞分化相关的靶基因只有1个,差异表达明显的miRNA对应的靶基因中没有富集于破骨分化通路的靶基因。5.当乳酸浓度达到20mmol/L,差异表达的miRNA靶基因影响的细胞组分与10mmol/L组没有明显区别,但与细胞凋亡及肿瘤相关的生物学过程增多。在差异表达明显的靶基因中,与破骨细胞分化相关的靶基因明显增多,并出现破骨分化通路富集。实验2:1.5mmol/L乳酸浓度条件下小鼠RAW264.7细胞的增殖率最高,20mmol/L乳酸浓度条件下的细胞增殖率最低;2.与对照组相比,10mmol/L乳酸浓度对小鼠RAW264.7细胞增殖率无统计学意义;3.在10mmol/L乳酸浓度条件下,TRAP染色阳性率最高,分化出的破骨细胞数量最多;4.Acp5、Nfatc1、RANK的m RNA在10mmol/L乳酸浓度条件的表达量最高;5.随着乳酸浓度的升高,Ctsk、Acp5、RANK的蛋白表达水平呈递增趋势;而Nfatc1的蛋白表达水平呈递减趋势;结论:1.在10mmol/L乳酸微环境下,单核细胞产生的外泌体miRNA中mmu-let-7b-5p,mmu-miR-712-5p和mmu-miR-3084-3p的靶基因与破骨细胞分化相关。2.乳酸浓度为10mmol/L是本实验条件下促小鼠RAW264.7细胞破骨向分化的最适浓度。
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