LncRNA BBOX1-AS1对胃癌细胞生物学功能的影响

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xuanwuba
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胃癌位于全球癌症发病率第五位,死亡率第四位,是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前,胃癌的发生和发展分子机制尚不明晰。既往研究表明多种lncRNA在胃癌中异常表达,并在胃癌的发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用。因此探索胃癌相关新型lncRNA的生物学功能和分子作用机制对阐明胃癌发生发展机制有着重要作用。目的:通过生物信息学的方法筛选胃癌中差异表达的lncRNA,并探索BBOX1-AS1在胃癌中的生物学功能和分子作用机制。方法:从GEO数据库下载胃癌相关数据集GSE53137、GSE70880和GSE99417,从TCGA数据库下载TCGA?STAD转录组数据及患者临床信息,采用R软件筛选差异表达的lncRNA。统计分析TCGA?STAD数据集中BBOX1-AS1在胃癌组织和胃正常组织中的差异表达,并分析BBOX1-AS1表达与胃癌临床病理特征的关系。采用GSEA分析BBOX1-AS1的生物学功能。通过RT-qPCR测定BBOX1-AS1在25对人胃癌组织及癌旁组织中的表达水平,并检测BBOX1-AS1在人源正常胃上皮细胞系GES-1和四种人源胃癌细胞系BGC823、AGS、MGC-803和HGC-27中的表达水平。利用FISH技术分析BBOX1-AS1的亚细胞定位。构建BBOX1-AS1敲降模型(采用高表达BBOX1-AS1的胃癌细胞系HGC27细胞),构建BBOX1-AS1过表达模型(采用低表达BBOX1-AS1的胃癌细胞系BGC823细胞),CCK-8验证BBOX1-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响,克隆形成实验检测BBOX1-AS1对胃癌细胞克隆形成能力的影响,transwell迁移实验测定BBOX1-AS1对胃癌细胞迁移能力的影响,流式细胞术检测BBOX1-AS1对胃癌细胞周期进程和凋亡的影响,WB实验检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的表达水平。利用在线软件JASPAR和LASAGNA Search 2.0预测cyclin D1启动子区域的潜在结合转录因子及其结合位点。WB实验检测STAT3途径相关蛋白磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平。结果:从GEO数据库胃癌相关数据集(GSE53137、GSE70880和GSE99417)和TCGA?STAD转录组数据中取交集筛选出15个差异表达的lncRNA。结合TCGA?STAD转录组数据,进一步分析显示BBOX1-AS1在胃癌组织中显著高表达。BBOX1-AS1表达与胃癌临床病理特征相关性分析结果显示,相较于高分级的胃癌组织,BBOX1-AS1在低分级的组织中表达显著增高。GSEA分析表明,BBOX1-AS1与癌症相关,可能参与MAPK、JAK/STAT和WNT等信号通路。RT-qPCR结果表明,与癌旁组织相比,BBOX1-AS1在人胃癌组织显著高表达;且BBOX1-AS1在四种人源胃癌细胞系BGC823、AGS、MGC-803和HGC-27中表达高于人源正常胃上皮细胞系GES-1。FISH结果显示BBOX1-AS1在细胞质和细胞核中均表达。CCK-8结果提示沉默BBOX1-AS1抑制胃癌细胞的增殖,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞的增殖。克隆形成实验证明沉默BBOX1-AS1抑制胃癌细胞的克隆形成能力,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞的克隆形成能力。Transwell迁移实验证实沉默BBOX1-AS1显著抑制胃癌细胞的迁移能力,而过表达BBOX1-AS1显著促进胃癌细胞的迁移能力。流式细胞术和WB实验结果提示,沉默BBOX1-AS1后,细胞周期停滞在G1期,并且抑制CDK4和cyclin D1的蛋白表达水平,而过表达BBOX1-AS1促进G1/S细胞周期转化,并且促进CDK4和cyclin D1的蛋白表达水平。JASPAR和LASAGNA Search 2.0网站在线分析显示转录因子STAT3在cyclin D1启动区域有多个结合位点。此外,沉默BBOX1-AS1可降低胃癌细胞中磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平,而过表达BBOX1-AS1则促进胃癌细胞中磷酸化STAT3和STAT3蛋白表达水平。结论:BBOX1-AS1在胃癌中高表达,促进胃癌细胞的增殖、迁移和细胞周期进程,可能通过激活STAT3途径促进胃癌发展,并且可能成为胃癌的潜在治疗靶点。
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