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研究背景结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染引起的呼吸道传染病。卡介苗(BacillusCalmette-Guerin,BCG)是目前唯一批准使用的结核病疫苗,但对成人结核病的保护效果不完善,可能与BCG在减毒传代过程中丢失了一些编码保护性抗原的基因序列有关,例如:差异编码区1(regiondifference,RD1)。因此,新型疫苗的研发有助于更好地防控结核病。6kDa早期分泌靶抗原(6kDaearlysecretoryantigenictarget,ESAT-6)是Mtb与BCG的差异抗原。研究发现,ESAT-6能够诱导机体产生抗Mtb感染的保护性免疫应答,被广泛用于结核病疫苗研究。目前,包含ESAT-6及其他抗原的四种疫苗已进入临床试验。此外,ESAT-6作为毒力因子与Mtb的致病性有关,且参与调控Mtb感染宿主的免疫应答。因此,ESAT-6是结核病疫苗研究中有潜能的候选抗原之一。然而,课题组前期研究发现,ESAT-6抗原诱导的机体免疫应答水平不高。研究发现,细菌信号分子环二腺苷酸(c-di-AMP)不仅调控细菌生理功能,还能诱导宿主固有免疫应答,且作为黏膜佐剂能够增强抗原诱导的特异性免疫应答。因此,本研究旨在探究ESAT-6的免疫学特性,评价ESAT-6亚单位疫苗及以c-di-AMP为佐剂黏膜接种对Mtb感染的保护作用,为ESAT-6用于结核病黏膜疫苗的研制提供理论与实验依据。研究目的探究MtbESAT-6同系物MsESAT-6在快速生长型分枝杆菌耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis,Ms)调控免疫应答中的作用;探究Mtb的重组ESAT-6蛋白对巨噬细胞固有免疫的调控作用;明确基于MtbESAT-6的亚单位疫苗以c-di-AMP为佐剂经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答特点,评价ESAT-6为基础的亚单位疫苗抗Mtb感染的保护效率。方法与结果(1)耻垢分枝杆菌ESAT-6敲除株的免疫学特性1)MsESAT-6是MtbESAT-6在Ms中的同系物,二者氨基酸序列相似性为72%。采用CRISPR/Cas9技术成功构建了MsESAT-6敲除株MsΔE6(ΔE6),并构建了互补菌株ΔE6C。生长及染色特性结果显示,敲除ESAT-6对细菌生长有一定影响,但不影响细菌抗酸染色特性。2)建立Ms体外感染巨噬细胞模型,发现ESAT-6在Ms感染诱导巨噬细胞产生炎症因子、诱导炎症小体活化以及自噬中发挥作用,但影响水平有限。3)细菌胞内存活结果显示,敲除ESAT-6的菌株在巨噬细胞内复制减少,说明ESAT-6与Ms在巨噬细胞内存活有关。(2)ESAT-6在调节巨噬细胞固有免疫中的作用1)建立巨噬细胞体外刺激模型,发现c-di-AMP促进了MtbESAT-6重组蛋白诱导的I型IFN应答;ESAT-6和c-di-AMP在处理早期可诱导巨噬细胞自噬起始,二者长时间处理主要表现为抑制自噬降解,该过程受mTOR调控但不依赖于IL-17。2)ESAT-6可诱导巨噬细胞炎症因子应答,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的炎症因子应答。3)Mtb胞内存活结果显示,在感染早期ESAT-6和c-di-AMP以协同的方式限制了Mtb的复制;随着感染时间延长,抑制Mtb生长的作用逐渐不明显。(3)ESAT-6亚单位疫苗的免疫学特性1)以ESAT-6、ESAT-6 c-di-AMP经鼻黏膜接种小鼠,体液免疫应答检测结果显示,ESAT-6可诱导机体系统性和黏膜局部特异性抗体产生,c-di-AMP为黏膜佐剂增强了ESAT-6诱导的体液免疫应答。2)细胞免疫应答检测结果显示,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的系统性Th1/Th2/Th17型以及炎症因子应答;同时促进了黏膜局部的Th17型和炎症因子应答。3)肺组织免疫细胞亚群分析结果显示,ESAT-6、ESAT-6 c-di-AMP接种导致CD8~ T细胞和巨噬细胞比例减少;同时,c-di-AMP为黏膜佐剂促进了ESAT-6诱导的固有淋巴样细胞ILC1和NK细胞的分化。(4)ESAT-6亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率1)ESAT-6免疫小鼠Mtb感染后黏膜免疫应答增强,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答。2)ESAT-6、ESAT-6 c-di-AMP免疫小鼠Mtb感染后,Th1型(IFN-γ)、Th2(IL-10)、Th17(IL-17)以及炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的产生均减少。3)ESAT-6、ESAT-6 c-di-AMP经黏膜接种小鼠提供了抗Mtb感染的保护作用,且c-di-AMP为佐剂在一定程度上提高了ESAT-6的免疫保护作用。研究结论MsESAT-6在Ms感染诱导的宿主固有免疫中发挥一定的作用,影响细菌胞内存活,整体上作用有限。MtbESAT-6与免疫调节子c-di-AMP协同激活I型IFN,调控细胞自噬,诱导炎症应答,促进了巨噬细胞清除Mtb感染。ESAT-6经黏膜接种,可诱导体液免疫应答,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答以及Th1/Th2/Th17型细胞免疫应答。ESAT-6经黏膜免疫可提供对Mtb感染的保护力,且c-di-AMP在一定程度上可提高ESAT-6的免疫保护效率。